常用阿爾茨海默病動物模型制備方法及評價

楊翠翠，李林，張?zhí)m

（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer＇s disease，AD）又稱老年性癡呆，是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是臨床較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變［1］。其腦部典型的病理改變?yōu)樯窠?jīng)元丟失，細胞外有大量由β－淀粉樣蛋白（βamyloid，Aβ）組成的老年斑（senile plaques，SP）、神經(jīng)細胞內(nèi)神經(jīng)纖維絲纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）等［1］。

目前，AD動物模型的建立有很多種，但每種動物模型均有局限性，并不能完全模擬AD的病理特征。該文對AD研究中常用動物模型進行綜述并對各類模型的優(yōu)缺點進行評價。

1 以Aβ為基礎(chǔ)的動物模型

Aβ是老年斑的主要組成成分。Aβ是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素［2，3］。

1.1 APP轉(zhuǎn)基因小鼠及APP／PS－1雙轉(zhuǎn)基因小鼠

淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）基因突變時，β－APP主要由β－2分泌酶和γ－2分泌酶作用裂解為 Aβ［4，5］，Aβ聚集可形成神經(jīng)毒性的原纖維，進而形成SP，從而加重AD的發(fā)展。轉(zhuǎn)APP基因模型是通過將外源性APP基因?qū)?，整合到基因組中后穩(wěn)定的表達并遺傳給后代。由于動物過多表達APP基因或其突變基因，導致Aβ沉積。1）Tg2576小鼠是轉(zhuǎn)人類APP695基因小鼠，6～8月時腦內(nèi)Aβ開始升高，10個月左右可見Aβ沉積，神經(jīng)炎斑形成，且隨年齡增加而加重，同時發(fā)現(xiàn)突觸丟失和小膠質(zhì)細胞增生［6］。此外，Tg2576小鼠Aβ淀粉變性可誘導tau蛋白聚積，使其空間記憶能力下降，對移位物體分辨能力降低［7］。2）APP23小鼠由轉(zhuǎn)人類APP695鼠和APP V717I鼠交配得來，3個月時出現(xiàn)空間記憶障礙，6個月時已有Aβ沉積，24個月時在皮質(zhì)和海馬出現(xiàn)大量Aβ，并且隨著年齡增長Aβ出現(xiàn)數(shù)量和體積增多［8］。3）APPswe／PS－1雙轉(zhuǎn)基因小鼠可表達人突變的PS－1（M146L）基因和APP（K670N，671N）基因，該轉(zhuǎn)基因小鼠在12w后，其皮層和海馬可見Aβ沉積，沉積隨年齡逐漸增加［9］。該模型主要應(yīng)用于研究PS－1在Aβ沉積中的作用。9個月時，轉(zhuǎn)基因鼠活動次數(shù)減少，空間記憶能力降低［10］。

評價：APP轉(zhuǎn)基因小鼠及APP／PS－1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是目前國際最為認可的AD動物模型，是AD藥效學評價的金標準。但其造價昂貴，成模周期較長，一定程度上制約了該模型的廣泛應(yīng)用。

1.2 Aβ注射擬AD動物模型

由于轉(zhuǎn)基因動物成本高，試驗周期較長，腦內(nèi)注射Aβ建立擬癡呆模型可一定程度替代轉(zhuǎn)基因模型用于研究Aβ與AD發(fā)病的關(guān)系及藥物干預(yù)。體外實驗表明Aβ在1mol濃度時即對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用。腦內(nèi)注射Aβ可使動物產(chǎn)生與AD相似的行為障礙和記憶缺損癥狀，Aβ沉積，氧化應(yīng)激損傷等［11］。注射Aβ是目前較常用的一種擬AD動物模型［12，13］，其制備方法有海馬內(nèi)單點注射、海馬內(nèi)多點注射、側(cè)腦室注射等。大鼠左側(cè)側(cè)腦室一次性注射聚集態(tài)的Aβ25－35，可以造成大鼠空間記憶能力降低，膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)，但并未有典型NFTs的形成［14，15］；Yamaguchi等［16］采用大鼠側(cè)腦室內(nèi)一次性注射聚集態(tài)Aβ25－35，發(fā)現(xiàn)AD模型大鼠出現(xiàn)學習記憶障礙。

評價：該模型成本少，試驗周期較轉(zhuǎn)基因動物短，可用于探討Aβ在AD中的發(fā)病機制。不足：1）對動物導入Aβ時，注射本身將對腦組織形成局灶性穿透性損傷；2）大量的Aβ聚集在注射位點局部而不是彌散地分布到腦內(nèi)。

2 以tau蛋白過度磷酸為基礎(chǔ)的模型

2.1 抑制tau蛋白磷酸酶（protein phosphatases，PPs）所致tau蛋白磷酸化模型及激活tau蛋白激酶所致tau蛋白磷酸化模型

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，具有穩(wěn)定微管，促進微管裝配的功能。異常過度磷酸化的tau蛋白是NFTs的核心。目前認為tau蛋白磷酸化是體內(nèi)多種蛋白激酶，如糖原合成酶激酶－3（GSK－3）、周期蛋白依賴性激酶－5（cdk－5）、蛋白激酶 A（PKA）等引起的磷酸化和PPs去磷酸化兩種作用失調(diào)所導致。根據(jù)以上原理，目前的動物模型制作主要分為抑制tau PPs所致tau蛋白磷酸化模型及激活tau蛋白激酶所致tau蛋白磷酸化模型。

岡田酸（okadaicacid，OA）是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酯酶抑制劑，是PP1和PP2A的抑制劑。將OA注射到大鼠側(cè)腦室或者海馬均可導致大鼠空間記憶力下降以及tau蛋白在ser396、ser199／202、ser404 等 位 點 的 磷 酸 化 顯 著 增 加［17，18］。Wortmannin（WT）能夠抑制磷脂酰肌醇3激酶抑制劑（PI3K）的活性，從而抑制GSK－3β在ser9位點的磷酸化而導致GSK－3β活性增高，因此 WT造?？梢詫е麓笫罂臻g記憶力下降，GSK－3β活性增加，tau蛋白在ser396／404和ser199／202等位點的磷酸化［19］。該模型只有tau蛋白高度磷酸化的表現(xiàn)，沒有Aβ的病理表現(xiàn)。

評價：以上兩種模型成模周期短，只有tau蛋白的病理表現(xiàn)，適合研究tau蛋白磷酸化相關(guān)的機制及拮抗tau蛋白磷酸化為靶標的藥物作用機制。但造模方式較為復雜，需定位準確，工具藥藥量適中。

2.2 轉(zhuǎn)人類tau蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物

為了闡明tau蛋白在AD病理過程中的發(fā)生機制，一些學者構(gòu)建了轉(zhuǎn)人類tau蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物，主要有P301L、轉(zhuǎn)人類野生型tau基因小鼠，其中P301L包括JNPL3與rTg4510。P301L出現(xiàn)神經(jīng)元丟失和NFTs，但不會出現(xiàn)Aβ淀粉樣斑塊，90%的動物會存在輕度運動功能障礙，在動物腦干、小 腦 和 脊 髓 中 均 可 見 NFTs［20，21］。 相 比 之 下，Ishihara等［22］在過表達人類最小tau蛋白片段轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬、扁桃體、內(nèi)嗅皮質(zhì)形成congophilic tau，并首次檢測出類NFTs的特定的并與β折疊片層結(jié)構(gòu)結(jié)合的包涵物。Andorfer［23］在過表達人類tau蛋白片段轉(zhuǎn)基因小鼠（tau蛋白基因敲除）中發(fā)現(xiàn)，6個月后在皮層、海馬部位出現(xiàn)tau蛋白磷酸化和NFTs，在紋狀體，小腦和脊髓中較少或無tau蛋白磷酸化和NFTs的產(chǎn)生，這與人類AD的病理變化相似。此鼠15個月出現(xiàn)神經(jīng)元丟失，與P301L不同的是，不出現(xiàn)運動功能的變化。

評價：轉(zhuǎn)基因動物發(fā)病時間長，在多個腦區(qū)出現(xiàn)tau蛋白磷酸化和NFTs，一定程度上模擬了人類AD病理變化和行為學改變特征。但存在成本高、外源基因不穩(wěn)定等問題。

3 同時表達Aβ和NFTs的動物模型

隨著實驗技術(shù)的完善和進步，出現(xiàn)了同時表達AD的兩大典型病理變化Aβ和NFTs的轉(zhuǎn)基因動物。Oddo等分別把兩種突變基因 APP－Swe和tauP301L顯微注射入單轉(zhuǎn)PS1M146V基因鼠純合子的胚胎干細胞中，經(jīng)篩選得到3xTg－AD小鼠。該轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)逐漸出現(xiàn)SP和NFTs，長時程增強電位隨年齡增長而逐漸下降，這一改變出現(xiàn)在SP和 NFTs形成之前［24－26］。

評價：多種轉(zhuǎn)基因組合方法全面模擬了AD主要病理變化和行為學改變特征。轉(zhuǎn)基因動物的缺點在于難以重復、外源性基因表達不穩(wěn)定、繁殖能力低下、抵抗疾病能力差、成本昂貴等問題。但是轉(zhuǎn)基因動物模型更能全面模擬AD發(fā)病的過程，具有廣闊的應(yīng)用前景，在越來越多的研究中得到應(yīng)用。

4 膽堿能損傷動物模型

膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)重要的化學物質(zhì)，它沿著中膈、海馬、基底前腦系統(tǒng)投射到皮質(zhì)，傳導沖動反復出現(xiàn)，使之有可能學習新的知識。AD患者腦中膽堿能神經(jīng)元缺失、突觸前乙酰膽堿的合成降低、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性和對膽堿的攝取能力明顯下降，這些變化與患者的認知功能損害程度呈正相關(guān)［27］。因此通過破壞動物大腦的膽堿能系統(tǒng)，導致學習記憶障礙而制作AD動物模型。

4.1 物理手段致膽堿能損傷模型

此動物模型主要通過損毀海馬傘使動物出現(xiàn)學習和記憶功能障礙而建立。Hefti等［28］通過切斷海馬傘的方式造成膽堿能神經(jīng)元丟失及動物空間定向和記憶障礙。此外，通過電損傷Meynert基底核也可導致動物大腦皮層乙酰膽堿含量明顯降低，從而破壞動物學習記憶能力。

評價：采用該方法建立動物模型周期較短，但手術(shù)定位困難，難免損傷手術(shù)附近部位。

4.2 化學手段致膽堿能損傷模型

此AD模型主要采用化學手段破壞膽堿能系統(tǒng)建立。大鼠腹腔注射東莨菪堿及樟柳堿（膽堿能拮抗劑）后，可阻斷動物大腦皮層中乙酰膽堿受體的結(jié)合位點，引起膽堿能系統(tǒng)功能障礙［29］。

另外，通過腦室或核周內(nèi)注射某些神經(jīng)毒素損害特定區(qū)域的神經(jīng)元，可導致學習記憶能力降低和膽堿能功能喪失。興奮性氨基酸主要有：海人酸（KailllCaeid，KA）、鵝 膏 覃 氨 酸 （Ibotenicaeid，IBO）、N－甲基－D－天門冬氨酸（NMDA）、使君子酸等，注入大鼠 Meynert基底核可建立AD模型［30］。此法可導致膽堿能神經(jīng)元減少、皮質(zhì)膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶（ChAT）活性降低，但不破壞通過此區(qū)域的神經(jīng)纖維。

評價：該模型可復制AD膽堿能功能減退的特征性病理變化，是AD藥物評價常用的動物模型。制模時需在應(yīng)用的藥物種類、劑量、作用部位及時間等方面優(yōu)化條件，才能獲得比較理想的模型病理狀態(tài)。該模型不出現(xiàn)AD的典型病理改變——老年斑和NFTs，因此只能應(yīng)用于膽堿能系統(tǒng)的機制研究及藥物評價。

5 衰老動物模型

AD是一個與年齡密切相關(guān)的疾病，衰老因素在AD發(fā)病過程中起著重要作用。隨著世界人口老齡化加重，AD的患病率明顯上升，給患者和社會帶來沉重的負擔。以衰老為AD發(fā)病基礎(chǔ)的動物模型成為實驗研究中不可或缺的部分。

5.1 自然衰老動物

通過動物的自然衰老獲得AD動物模型，包括老齡化小鼠、大鼠、猴及狗等。此模型的認知功能障礙等神經(jīng)系統(tǒng)改變是自然發(fā)生的，與AD真實的病理生理改變更為接近［31］。大鼠、小鼠及猴是自然衰老模型中較為常用的動物。老年大鼠、小鼠及猴出現(xiàn)突觸缺失、膽堿能神經(jīng)元減少、Aβ沉積等病理變化［32，33］

近年來研究表明，老年狗能夠出現(xiàn)類似AD的記憶力障礙，但是缺少檢測狗記憶力障礙的合適手段。Salvin等［34］最近研發(fā)出一種sand maze用來檢測狗空間記憶能力，并發(fā)現(xiàn)老年狗穿越目標區(qū)域次數(shù)明顯低于青年狗。

評價：1）AD是一種不同于正常衰老的進行性神經(jīng)退行性疾病，故老齡動物有其局限性，只是模擬了部分與人類正常衰老相關(guān)的神經(jīng)變化改變，并不能全面模擬AD的變化。2）飼養(yǎng)周期和實驗周期長、病死率高等缺點，大大限制了該模型的應(yīng)用。

5.2 快速老化小鼠（senescence accelerated mouse，SAM）模型

SAMP8小鼠與自然衰老小鼠相似，有類似老年癡呆腦部病理改變及學習記憶功能降低的變化［35］，但與自然衰老小鼠或者大鼠相比，其出現(xiàn)類似AD腦內(nèi)病理變化較早。有研究表明，10月齡SAM鼠與22月齡wistar大鼠均能出現(xiàn)氧化損傷、炎癥反應(yīng)及凋亡［36］。1～5月齡的SAMP8鼠腦內(nèi)即出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化，氧自由基增加，學習記憶力損傷等變化［37］。在5月齡的時候，與SAMR1相比，SAMP8鼠腦內(nèi)出現(xiàn)tau蛋白高度磷酸化，其中海馬、皮層、紋狀體較為明顯，小腦內(nèi)無tau蛋白高度磷酸化［38］。

評價：該模型衰老時間短，出現(xiàn)AD腦內(nèi)病理變化早，縮短研究周期。缺陷：1）SAMP8小鼠與AD發(fā)病過程和機制是否一致有待進一步研究；2）實驗成本高；3）SAMP8小鼠壽命短，不適合用于長周期的實驗。

5.3 D－半乳糖誘導的亞急性衰老動物模型

注射D－半乳糖誘導后，動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)可出現(xiàn)例如動物學習能力下降，神經(jīng)細胞病理改變，神經(jīng)元丟失，線粒體腫脹呈空泡狀等退行性病變，與老年動物腦內(nèi)病理變化表現(xiàn)一致，故其常作為抗衰老藥物研究模型［39］。羅煥敏等［40］將NIH小鼠腹腔注射D－半乳糖120mg／kg連續(xù)60d，小鼠大腦皮層出現(xiàn)類老年斑的病理改變，在海馬區(qū)可見神經(jīng)元變性壞死。但此類模型未出現(xiàn)NTFs及老年斑樣改變。

6 損傷線粒體動物模型

線粒體異常的氧化磷酸化，尤其是COX在AD發(fā)病中的作用引起了人們的重視。多項研究表明，AD患者線粒體內(nèi)COX活性明顯減少且較為特異［41－45］。Mosconi利用正電子斷層掃描（Positron Emission Tomography，PET）檢查顯示AD患者腦組織氧化和能量代謝受損，主要表現(xiàn)為腦顳部及頂部葡萄糖利用（glucose utilization，GU）減少［46］。目前研究發(fā)現(xiàn)采用NaN3可造成動物學習記憶障礙。采用微泵長期、緩慢、恒速地在大鼠皮下灌注一定濃度的NaN3后進行Morris水迷宮實驗，測定后發(fā)現(xiàn)其空間學習記憶能力受到損傷，holeboard迷宮實驗結(jié)果也表明其存在空間記憶保持的缺陷［47］。有學者研究表明，微泵恒速皮下灌注NaN31mg／（kg·h），30d 即 可 出 現(xiàn) 學 習 記 憶 障 礙（Morris水迷宮和避暗反應(yīng)），但不引起大鼠興奮性、新異環(huán)境感知和緊張情緒的改變（曠場分析）；增加劑量致2mg／（kg·h），模型大鼠學習記憶障礙加重，且出現(xiàn)興奮性，新異環(huán)境感知和緊張情緒的異常。此模型大鼠腦內(nèi)可出現(xiàn)ChAT活性降低和海馬神經(jīng)元損傷。

評價：此模型模擬AD長時程、進行性惡化的發(fā)病特點。NaN3有毒性，造模時需要對其用量及實驗操作手段嚴格要求。此外，造模所用微泵價格昂貴，造模成本較高。

7 結(jié)語

目前常用的AD動物模型多為針對特定發(fā)病機制和靶點而制備，因此多數(shù)模型只能模擬AD諸多病理變化中的一個側(cè)面，而不能全面體現(xiàn)AD的病理、生化及神經(jīng)行為學等方面的全部變化特征。我們應(yīng)根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪x擇合適的模型。隨著對AD發(fā)病分子機制認識的不斷深入，能模擬AD多個發(fā)病環(huán)節(jié)及病理進程的新動物模型將不斷出現(xiàn)。

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