廣西地區(qū)乙肝病毒基因分型與臨床表現及機體免疫功能關系的研究

鐘大妮等

【摘要】 目的：研究廣西地區(qū)乙肝病毒基因型分布及與臨床表現及機體免疫功能的關系。方法：收集廣西地區(qū)原籍人口不同病情的慢性乙肝病毒相關性疾病包括無癥狀攜帶者（ASC）、慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、乙肝后肝硬化（LC）、原發(fā)性肝癌（HCC）血液標本，檢測乙肝病毒血清學標志物（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc和抗-HBcIgM），HBVDNA拷貝數，肝功能，T淋巴細胞亞群，型特異性引物巢式PCR及測序鑒定病毒基因型，利用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行資料分析。結果：本研究檢測納入的研究對象感染乙肝病毒為B、C兩種基因型，未檢測到其他基因型，以C型（66.3%）為主，B型（33.7%）次之。C基因型的HBeAg血清轉換率低于B型（P<0.05）。C型在肝癌組的比例顯著高于其他疾病組（P<0.05），不同基因型間年齡、HBVDNA拷貝數、AST、ALT、T細胞亞群CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）的差異無統(tǒng)計學意義。結論：廣西地區(qū)乙肝病毒感染相關性肝病患者HBV基因型為B型、C型，以C型為主，C型與較嚴重病情有關，感染不同HBV基因型與機體的免疫狀況無明顯相關。

【關鍵詞】 乙肝病毒； 基因型； 臨床表現； T淋巴細胞亞群

乙型病毒性肝炎是危害嚴重的慢性傳染性疾病，迄今全世界至少有3.5億人感染乙肝病毒（HBV）[1]。廣西是乙肝病毒的高流行區(qū)，人群中乙肝病毒的攜帶率基數大，乙型肝炎發(fā)病率約為60.5/10萬[2]。慢性HBV感染致肝細胞炎癥損傷，遷延反復，導致肝細胞壞死及纖維結締組織增生，發(fā)展為肝硬化、肝細胞癌，嚴重威脅人類生命健康[3]。近年研究發(fā)現乙肝病毒可根據全基因序列差異>8%或S基因片段差異>4%分為A-H共8個基因型，在我國主要是B型和C型[4]；HBV傳播方式、臨床表現、疾病轉歸、抗病毒治療效果與病毒的基因分型都有一定的相關性[5]。為了解廣西地區(qū)乙肝病毒基因分型和致病性差異，病毒基因型和不同嚴重程度慢乙肝機體免疫功能的差異的關系，本研究收集了廣西原籍人口無癥狀乙肝病毒攜帶者（ASC），輕、中、重慢乙肝患者（CHB），乙肝肝硬化（LC）以及肝癌（HCC）患者血清標本，進行不同疾病譜的HBV基因型分析及比較感染不同基因型的機體T淋巴細胞亞群情況。

1 材料與方法

1.1 材料 乙肝病毒標記物試劑盒（艾康生物技術（杭州）有限公司）；高速冷凍離心機（Eppenndorf Centeifuge，德國）；PCR擴增儀（PTC-220MJ Reaearch， USA）；DYY-2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；紫外分析儀（UV-1700（E）230CE，日本島津公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國Becton-Kickin-son公司）；血清病毒DNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；PCR Mix緩沖液及超純水（大連寶生物有限公司）；東勝Marker（上海東勝生物公司）；瓊脂糖（日本TaKaRa公司）；FACSCount Reagent Kit（美國BD公司）引物設計參照文獻[6]報道，分別為兩條外引物P1、P1R；公用上游引物P2，A、B、C三型特異下游引物；公用下游引物P3R，D、E、F三型特異上游引物，共10條引物，由生工生物（上海）有限公司生產。血液樣本來源于2008-2011年廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院傳染科門診及住院部、肝膽外科住院部，廣西醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院住院部患者，診斷符合2005年修訂《慢性乙型肝炎防治指南》[7]，入選患者排除甲肝、丙肝、戊肝、HIV、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病。

1.2 方法

1.2.1 HBV marker（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）檢測 嚴格按照酶聯免疫吸附法試劑盒操作。對乙肝病毒表面抗原（HBsAg）陽性者，送廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院做熒光定量PCR檢測HBVDNA拷貝數。

1.2.2 血清病毒基因型檢測 血清病毒DNA提取按照試劑盒說明書。取2 μl乙肝病毒DNA提取液，巢式PCR方法參照文獻，條件稍作改動[6]。在0.5 ml離心管中加入上下游外引物（50 pmol/L）各1 μl，25 μl PCR Mix，2 μl病毒DNA提取液，加21 μl超純水至50 μl，輕微震蕩混勻后，進行第1輪PCR擴增。取2 μl每一個樣本的第一輪PCR產物加上A、B、C引物和對應的公用引物（50 pmol/L）各1 μl，PCR Mix、超純水按照第一輪加入。在另一離心管D、E、F基因型的檢測同前所述。將兩組巢式PCR產物進行凝膠電泳，參照Marker得到產物的相對分子質量判斷基因型，A型為68 bp，B型為281 bp，C型為122 bp，D型為119 bp，E型為167 bp，F型為97 bp。對不能用巢式PCR成功分型的樣本送生工生物工程（上海）有限公司測序。并隨機選擇10個成功分型的樣本測序以鑒別本實驗分型的可靠性。

1.2.3 T淋巴細胞亞群檢測 對慢乙肝組患者進行流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD8：每個12×75 mm樣品測定管加入50 μl抗凝血（EDTA-K2抗凝），各管加入10 μl三色單抗，輕微振蕩混勻，室溫避光放置20 min；加1 ml溶血素裂解紅細胞，輕微振蕩，避光10 min，接著離心棄上清2次，加PBS后上機檢測。取50 μl全血加10 μl IgG1-FITC/IgG1-PE/IgGl-PE-Cy5（小鼠），作為陰性對照，其他步驟同上。每份標本測定5000個細胞，全部數據用流式細胞儀和軟件SYSTEM II獲取和分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 HBVDNA先進行對數轉換后再進行比較。統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件，計量資料以（x±s）表示，均數的比較采用t檢驗或F分析，率的比較采用 字2檢驗，雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究病例納入情況 共收集病例ASC46例，CHB103例，LC58例，HCC46，所有病例乙肝表面抗原（HBsAg）均為陽性，排除病毒DNA拷貝數<1×103后，得到最后研究病例ASC 31例，CHB 85例（輕度17例，中度36例，重度32例），LC 30例，HCC 35例。男性144例，女性37例，年齡13～84歲。每個病例組的平均年齡、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、乙肝病毒DNA拷貝數及乙肝病毒e抗原（HBeAg）的情況見表1。

2.2 HBV基因分型 將PCR產物在1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳，基因分型為B型或C型，未檢測到B、C混合型，未發(fā)現其他基因型。將測序結果與NCBIGene數據庫病毒序列比對得到測序的基因分型為B型或C型。所有病例中B型61例（33.7%），C型120例（66.3%），發(fā)病者主要集中在大于30歲的人群，C基因型的>30歲患者比重較大。各疾病譜基因分型及對應的指標值見表2。

2.3 各疾病譜基因型分布 HCC組 C型的比例（91.4%）均高于ASC（67.7%）、CHB（56.5%）、LC（63.3%），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。ASC組、CHB組、LC組組內的C型比例較B型高，但組間分布差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 乙肝病毒e抗原與基因型 B型組HBeAg（+）為36.1%，低于C型組的HBeAg（+）的60%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。

2.5 乙肝病毒基因型與病毒DNA拷貝數 B型HBVDNA平均拷貝數為2.21×107，C型的為1.31×107，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.333）。

2.6 乙肝病毒基因型與ALT、AST的關系 B基因型組與C基因型組ALT、AST差異均無統(tǒng)計學意義（PALT=0.486，PAST=0.673）。ASC、CHB、LC、HCC組內比較也發(fā)現ALT、AST與基因型無關。

3 討論

據文獻報道，我國流行的HBV基因型主要為B型和C型，但各地區(qū)基因型分布情況不盡相同。本研究發(fā)現，廣西地區(qū)原籍人口中感染的HBV基因型主要為C型，其次為B型。據文獻報道，北京、黑龍江及廣東、河南、山西等多地區(qū)的主要流行基因型也是C型[8-11]，提示我國的主導基因型為C型，廣西HBV基因型分布與全國一致。

本研究結果表明，廣西地區(qū)原籍人口C基因型的乙肝病毒相關性肝病的發(fā)病主要是在25歲之后，這與Yin等[12]先前在國內做的社區(qū)調查的報道相似。廣西是HCC高發(fā)區(qū)之一，本研究顯示，HCC組C基因型的比例均明顯高于ASC、CHB、LC組，表明C基因型與肝癌的進展密切相關[13]。對30歲以上的乙肝病毒攜帶者檢測病毒基因分型有助于預測肝癌發(fā)病風險[14]。有研究報道，C基因型引起的肝臟疾病臨床表現的嚴重程度較B型高，包括較高的肝癌術后復發(fā)率、延遲的血清轉換、較高的DNA拷貝數、較高的ALT水平[14-15]；也有研究報道B基因型引起的臨床表現較為嚴重[12，16]；Zeng等[17]報道B、C基因型的肝病嚴重程度包括肝功能、肝臟炎癥、纖維化差異并無統(tǒng)計學意義。本研究中廣西地區(qū)原籍人口C型HBeAg血清轉換率顯著低于B型的，提示HBV C基因型感染患者病毒的復制與感染性較B基因型高，但兩種HBV基因型的ALT、AST及HBVDNA水平無顯性差別。報道的不一致可能與地區(qū)分布的乙肝病毒流行特點、病毒亞型及患者的環(huán)境因素、生活習慣有關[18]。

一般認為，HBV致肝臟損害主要由機體對HBV免疫應答介導，肝細胞感染HBV后在細胞表面表達的病毒可引起細胞毒性T細胞反應，多種因素可影響這種免疫應答的強度，其中包括病毒遺傳物質多態(tài)性[19-20]。為了解HBV基因型是否與機體T細胞免疫有關，本研究比較了慢性HBV感染相關性肝病患者B、C基因型外周血的T細胞亞群CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）的數量，結果表明，C基因型的CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）T細胞與B型均無顯著性差別，此結果可能與研究樣本相對較小有關。綜上所述，廣西地區(qū)流行的HBV以B型、和C型為主，未見其他基因型，或B、C重疊情況。C基因型與較嚴重的HBV感染相關性肝病病情有關，HBV基因型與機體細胞免疫狀態(tài)的關系仍需進一步加大樣本量進行研究。

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（收稿日期：2012-11-23） （本文編輯：陳丹云）