黃金蒲桃組織培養(yǎng)初步研究

莫健斌，陳文燕，馬 斌，潘國平

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

黃金蒲桃(Xanthostemon chrysanthus F.Muell. ex Benth)，桃金娘科植物，常綠喬木，原產(chǎn)澳大利亞，是澳洲特有的代表植物之一，為昆士蘭省凱恩斯市(Cairns)市花?；ǔ蹰_時黃綠色，隨著開花時間延長，轉(zhuǎn)為黃色，凋謝時為金黃色。整團(tuán)花序遠(yuǎn)觀有如絨球，是花色特殊的珍奇花木。黃金蒲桃樹形優(yōu)美，木質(zhì)相當(dāng)好，為首選的園景木和行道樹之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。黃金蒲桃在中國引種范圍十分狹小，僅在福建、廣東等少部分地區(qū)有栽種。地域、氣候等差異引起黃金蒲桃花期縮短，結(jié)實率不高，被稱為黃金熊貓。目前黃金蒲桃的繁殖主要為傳統(tǒng)的播種方式，此方式繁殖率低，生長周期長，不能滿足經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖黃金蒲桃，可以克服喬木生產(chǎn)短缺的不足，在短時間內(nèi)大量繁殖組培苗，供生產(chǎn)上使用。本研究不僅在黃金蒲桃的商品化上具有一定的實踐意義，而且為木本植物的離體快速繁殖提供理論及實踐指導(dǎo)。本試驗通過對黃金蒲桃初代培養(yǎng)的研究，為黃金蒲桃的深入研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

選取地點為暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，具有20 a樹齡黃金蒲桃的未老熟枝條。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理 黃金蒲桃的酚化合物含量高，容易引起褐變[1-2]。陰雨天氣采摘的外植體褐變率十分高，因此采摘外植體時最好是選擇艷陽天。老化的枝條褐變率高，且不易脫分化和再分化，應(yīng)選擇新生的帶紅色嫩葉的枝條[3-4]，同時，過嫩的枝條在培養(yǎng)過程中容易死亡，采摘時也不宜選擇太嫩的枝條，枝條的長度為4 cm即可。采摘好的枝條用自來水沖洗30 min，沖洗過后，用洗衣粉液浸泡10 min，將浸泡后的枝條用自來水沖洗干凈。取干凈的燒杯，將處理好的枝條置于燒杯中，用Vc浸泡2 h，隨后，再置于冰箱中冷藏12 h。取出冰箱中的材料，將其轉(zhuǎn)移到干凈的無菌操作臺，用73%的酒精浸泡外植體30 s，確保酒精覆蓋了外植體，同時不停地?fù)u晃燒杯，用無菌水沖洗外植體2次，然后用HgCl2浸泡10 min，同時不停搖晃，后用無菌水沖洗8次左右。用無菌濾紙將外植體表面的水分吸干，待接種在培養(yǎng)基上。

1.2.2 不同條件對啟動培養(yǎng)的影響

(1)不同消毒條件對啟動培養(yǎng)的影響。探討不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化汞溶液處理莖段對啟動培養(yǎng)產(chǎn)生的影響，選取長勢相同、已預(yù)處理過的黃金蒲桃莖段分別浸泡于0.1%和0.5%的氯化汞溶液中，浸泡時間均為10 min。30 d后觀察試驗結(jié)果并統(tǒng)計。

(2)不同pH對啟動培養(yǎng)的影響。培養(yǎng)基中不同的pH值會影響植物的生長[5]，將培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為5.0和6.0，再將帶腋芽莖段的黃金蒲桃分別接種到這2種培養(yǎng)基中，30 d后觀察試驗結(jié)果。

(3)不同季節(jié)對啟動培養(yǎng)的影響。分別在夏季(即2012年6，7，8月)和冬季(2012年12月、翌年1，2月)接種黃金蒲桃?guī)б秆壳o段。30 d后觀察實驗結(jié)果并統(tǒng)計。

1.2.3 不同條件對芽誘導(dǎo)的影響

(1)不同基本培養(yǎng)基對芽誘導(dǎo)的影響。黃金蒲桃為木本植物，選取適合木本植物組織培養(yǎng)的WPM[6]和Andersson配方做為莖段誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基。分別將黃金蒲桃?guī)б秆壳o段接種在這2種基本培養(yǎng)基上，30 d后觀察試驗結(jié)果并統(tǒng)計，比較這2種培養(yǎng)基對啟動培養(yǎng)的影響。

(2)不同取材部位對芽誘導(dǎo)的影響。植物不同部位在相同的培養(yǎng)條件下，芽誘導(dǎo)率和死亡率有所差異，試驗選用頂芽和莖段作為芽誘導(dǎo)的材料，比較2者對芽誘導(dǎo)的影響。30 d后觀察試驗結(jié)果并統(tǒng)計。

(3)不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合對芽誘導(dǎo)和叢芽生長的影響。將黃金蒲桃?guī)б秆壳o段接種于每種激素組合的培養(yǎng)基中，每個因素設(shè)置3個質(zhì)量濃度水平，因素水平見表1，每瓶接種1個莖段，每一組合接種20瓶，重復(fù)3次，30 d后觀察試驗結(jié)果并統(tǒng)計，所有的值取3次試驗的平均值，利用SPSS軟件分析不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合對芽誘導(dǎo)的影響。

表1 不同質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合 mg/L

如無特別說明，以上培養(yǎng)基均以Andersson配方為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含有30 g/L的蔗糖、8 g/L的瓊脂，0.5 mg/L的6-BA和0.1 mg/L的NAA，pH在6.0±0.2之間。光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時間24 h，溫度為25℃。將處理好的無菌外植體在無菌操作臺切成1 cm左右，再將帶1個腋芽的莖段接種在Andersson配方培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基接種1個莖段。

1.3 試驗器材

試驗所需的基本器械有鑷子、解剖刀、三角瓶、剪刀，高壓滅菌鍋，培養(yǎng)箱等。所有的試驗器械在無菌操作前均要進(jìn)行滅菌工作。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗結(jié)果采用 SPSS19.0軟件及 ex-cel2003進(jìn)行分析，所用的方法為卡方檢驗法(Chisquare test)。激素質(zhì)量濃度組合對芽誘導(dǎo)和叢生芽生長的影響用鄧肯新復(fù)極差檢驗法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒條件對啟動培養(yǎng)的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化汞處理莖段后，對啟動培養(yǎng)的影響見表2，結(jié)果表明，褐變率差異達(dá)到顯著水平(x2=4.667，P＜0.05)，消毒液質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，褐變率越低;污染率的差異達(dá)到極顯著水平(x2= 7.461，P＜0.01)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，污染率越高。說明要讓莖段處理后褐變率低、污染率低，則必須控制好氯化汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由于氯化汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)對污染率的影響相對對褐變率的影響較大，為了使試驗獲得較多的無菌苗，可適當(dāng)提高氯化汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但不能超過0.5%。

表2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化汞溶液對啟動培養(yǎng)產(chǎn)生的影響

2.2 不同pH對啟動培養(yǎng)的影響

試驗結(jié)果表3，不同pH的褐變率差異達(dá)到顯著水平(x2=5.556，P＜0.05)，pH越低，褐變率越高;不同 pH的污染率差異也達(dá)到顯著水平(x2= 5.922，P＜0.05)，pH越低，污染率越低，這可能是低的pH值不適合雜菌的生長，因此，在pH較低的環(huán)境中，污染率也較低。說明要讓莖段處理后褐變率低、污染率低，則必須控制好pH，由于在低pH環(huán)境中，會使莖段長芽的時間延長，為了快速繁殖無菌苗，pH最好采用6.0。

表3 不同的pH值對啟動培養(yǎng)產(chǎn)生的影響

2.3 不同季節(jié)取材對啟動培養(yǎng)的影響

分別在夏季和冬季取材，處理莖段后，對莖段進(jìn)行離體培養(yǎng)，不同季節(jié)取材對啟動培養(yǎng)產(chǎn)生的影響見表4，結(jié)果表明，不同季節(jié)取材對褐變率的影響達(dá)到了極顯著水平(x2=42.593，p＜0.01)，夏季的褐變率明顯高于冬季;不同季節(jié)取材對污染率的影響也達(dá)到了極顯著水平(x2=15.686，p＜0.01)，夏季的污染率明顯高于冬季?？梢姡m然外植體是在恒溫箱中培養(yǎng)的，但由于外植體是在不同季節(jié)摘取的，即接受了不同的自然光照時間長度和不同溫度條件等，因此，對試驗無菌苗的獲取率也有影響，為了獲得更多的無菌苗，黃金蒲桃的離體培養(yǎng)適合在冬天進(jìn)行。

表4 不同季節(jié)對啟動培養(yǎng)產(chǎn)生的影響

2.4 不同基本培養(yǎng)基對芽誘導(dǎo)的影響

不同的培養(yǎng)基對離體組織的芽誘導(dǎo)效果有差異，試驗結(jié)果表明，在接種了100個相同的莖段后，WPM和Andersson培養(yǎng)基可獲得的無菌無褐變莖段數(shù)分別為37，34個，芽誘導(dǎo)數(shù)分別為23，25個，經(jīng)卡方檢驗，WPM和Andersson培養(yǎng)基對芽誘導(dǎo)的影響沒有明顯的差異(x2=1.045，p＞0.05)。說明這2種培養(yǎng)基均可以作為誘導(dǎo)黃金蒲桃莖段長芽的基本培養(yǎng)基。

2.5 不同取材部位對芽誘導(dǎo)的影響

取材部位不同，其分化的程度不同，因此對芽誘導(dǎo)也有所影響，試驗結(jié)果表明，在接種了100個頂芽和莖段后，褐變數(shù)分別為44，32個，污染數(shù)分別為19，34個，無菌無褐變數(shù)分別為37，34個，芽誘導(dǎo)數(shù)分別為31，28個。經(jīng)卡方檢驗，不同取材部位對褐變率的影響沒有明顯的差異(x2=3.056，p＞0.05)，對芽誘導(dǎo)數(shù)的影響也沒有顯著差異(x2=0.026，p＞0.05)，對污染率的影響有顯著的差異(x2=5.776，0.01＜p＜0.05)。說明頂芽的雜菌相對莖段比較少，但黃金蒲桃的頂芽在離體培養(yǎng)過程中較容易褐變死亡，而褐變是黃金蒲桃較難攻克的問題，因此，莖段仍是目前較為理想的試驗材料。

2.6 不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對芽誘導(dǎo)的影響

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對芽誘導(dǎo)的影響見表5，根據(jù)方差分析結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度的6-BA、NAA、IBA組合均有利于芽的誘導(dǎo)和叢生芽的生長，6-BA質(zhì)量濃度的變化對芽的誘導(dǎo)和叢生芽的生長有著極顯著的影響，而NAA只對芽的誘導(dǎo)有顯著的影響，IBA對芽的誘導(dǎo)和叢生芽的生長均沒有顯著的影響，說明在芽誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞分裂素起著重要的作用。生長素對芽的誘導(dǎo)也有促進(jìn)作用，但效果沒有細(xì)胞分裂素明顯，且高質(zhì)量濃度的生長素容易抑制芽的誘導(dǎo)。此外，6-BA與NAA組合效果比6-BA與 IBA組合效果好。在黃金蒲桃芽的誘導(dǎo)和叢生芽的生長過程中，最適宜的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)質(zhì)量濃度組合為0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其芽誘導(dǎo)率高達(dá)91.3%，每個莖段平均叢生芽數(shù)為3.2。

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對芽誘導(dǎo)的影響

3 討論與小結(jié)

從試驗結(jié)果可知，適當(dāng)提高氯化汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以獲得較多的無菌苗，同時要控制好氯化汞的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，因為氯化汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，褐變率也越高。pH能影響褐變率和污染率，pH越低，污染率越低，褐變率越高，培養(yǎng)黃金蒲桃組培苗適宜的pH為6.0。黃金蒲桃外植體在夏季的污染率和褐變率都特別高，可能原因是，夏季取材時，外植體在自然光照條件下，光照較充足，且夏季溫度較高，這些因素均有利于提高植物體內(nèi)酚類酶活性，因而夏季褐變率會相對較高。與此同時，冬季取材，外植體的褐變率和污染率都相對較低，因此黃金蒲桃適宜在冬季進(jìn)行組培試驗。WPM和Andersson培養(yǎng)基都是適合喬木組培的基本培養(yǎng)基，通過比較分析，發(fā)現(xiàn)這2種培養(yǎng)基對黃金蒲桃外植體培養(yǎng)的影響無明顯的差異。頂芽和莖段對褐變率的影響沒有顯著的差異。取材部位越嫩，污染率會低，可能原因是頂芽的雜菌較少，而莖段的篩管組織內(nèi)本身就存在著雜菌，此不能通過氯化汞等消毒劑在體外除去的，因此，其污染率會比頂芽高點。試驗研究過程中發(fā)現(xiàn)，雖然頂芽污染率低，但其死亡率比莖段要高得多，最終收獲的無菌無褐變數(shù)相對也會較少，因而莖段是黃金蒲桃組培理想的取材部位。外源植物生長調(diào)節(jié)劑是影響植物芽誘導(dǎo)的重要因素，低質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)和生長素類物質(zhì)組合能夠有效誘導(dǎo)芽的生長。 6-BA對芽誘導(dǎo)的影響最大。適當(dāng)?shù)?-BA和 NAA組合能促進(jìn)芽的誘導(dǎo)，其芽誘導(dǎo)率最高能達(dá)91.3% 。最佳質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合為0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

木本植物的生長周期長，組培是進(jìn)行木本植物最為有效的一種快速繁殖技術(shù)方法，但木本植物組培比草本、藤本等困難得多。目前世界上成功快速繁殖出木本植物的只有100多例[7]。本試驗首次對黃金蒲桃進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究，并成功誘導(dǎo)出大量叢芽，為進(jìn)一步建立該樹種完整的組培快繁體系奠定了基礎(chǔ)。

[1]郝英超，羅 磊，劉云宏，等.酶促褐變中酚類化合物代謝機(jī)理研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊)，2013，316(5):55-58，66.

[2]Tang W，Newton R J.Increase of polyphenol oxidase and decrease of polyamines correlate with tissue browning in Virginia pine(Pinus virginiana Mill.)[J].Plant Science，2004(167):621-628.

[3]Chevre A M.In vitro vegetative multiplication of chestnut[J]. Scientia Horticulturae，1983，58(1):23-29.

[4]尤海波，司 亮.蝴蝶蘭組織培養(yǎng)過程中減輕外殖體褐化的方法研究[J].中國林副特產(chǎn)，2009，101(4):19-21.

[5]王 棟，買合木提·克衣木，玉永雄，等.植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(1):7-10.

[6]曹 昆，李 霞.木本植物組織培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)研究進(jìn)展[J].江蘇林業(yè)科技，2008，35(5):43-48.

[7]李青林，鄒永田，劉廣林，等.木本觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，14(6):38-41，51.