冠心病患者外周血TL1A表達(dá)水平及臨床意義

紀(jì)玉強(qiáng)，劉佩勇，謝 梅，趙 朝，程曼麗(西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710002;通訊作者，E-mail:jiyuqiang112299@126.com)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)簡稱冠心病，是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。近年來越來越多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)、T細(xì)胞參與了動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的各個階段［1，2］。腫瘤壞死因子配體相關(guān)分子 1A(tumor necrosis factor lingand-related molecule-1A，TL1A)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族的成員，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，最近研究表明TL1A還可以活化T細(xì)胞，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)，在免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［3-6］。為了進(jìn)一步研究TL1A在冠心病中的作用，本研究檢測不同類型冠心病患者外周血中TL1A表達(dá)水平，初步探討TL1A在冠心病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2012-03～2012-12在西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科住院的冠心病患者90例，根據(jù)WHO冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)組25例、不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina pectoris，UA)組30例、穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris，SA)組35 例。

AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)為符合以下3項(xiàng)中的任2項(xiàng):①持續(xù)劇烈胸痛30 min以上;②典型的心電圖動態(tài)演變;③心肌損傷標(biāo)志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)或肌鈣蛋白(TnI)等有動態(tài)變化。

UA診斷標(biāo)準(zhǔn):患者入院前48 h內(nèi)出現(xiàn)過靜息性胸痛，一過性的ST段水平或下斜行壓低≥1 mm伴或不伴有T波倒置，無CK-MB或TnI升高2倍以上，冠狀動脈造影至少有1支血管直徑狹窄＞50%。

SA診斷標(biāo)準(zhǔn):典型的勞力性心絞痛伴有運(yùn)動試驗(yàn)陽性，冠狀動脈造影至少有1支血管直徑狹窄＞50%。

排除標(biāo)準(zhǔn):6個月內(nèi)的心肌梗死、發(fā)病到抽血時間≥24 h、炎癥性疾病、自身免疫性疾病、心房顫動、心臟瓣膜病、肝腎疾病、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病。

35例同期住院的經(jīng)冠狀動脈造影證實(shí)所有血管直徑狹窄＜50%及排除冠狀動脈痙攣的住院患者為對照組。本研究得到我院倫理委員會批準(zhǔn)并取得所有受試者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 人TL1A ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司，RNA提取液TRIzol購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自大連寶生物工程有限公司，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)，DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo公司)。

1.2.2 實(shí)時定量PCR檢測外周血TL1A mRNA的表達(dá)水平 所有研究對象在入院時抽取靜脈血3 ml，利用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，加入1 ml TRIzol液提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。參照Genbank cDNA中的TL1A及內(nèi)參GAPDH基因序列利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，TL1A上游引物5’-TTTGGGGAAACAGCCAGTGT-3’，下游引物5’-GGTGTGCCCTTGGCTTATCT-3’，產(chǎn)物大小271 bp;GAPDH上游引物5’-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3’，下游引物5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’，產(chǎn)物大小104 bp。20 μl PCR 反應(yīng)體系:10 μl SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)、PCR 上、下游引物(10 μmol/L)各2 μl、6 μl DNA 模板。PCR 反應(yīng)條件:95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s、60℃ 30 s 40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后采用Bio-Rad iQ520分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血漿中TL1A水平 所有研究對象在入院時抽取靜脈血2 ml，分離血漿-20℃保存待測。采用ELISA試劑盒測定血漿中的TL1A的含量，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，每個樣本做3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象臨床資料比較

各組研究對象在年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇及高密度脂蛋白膽固醇等因素的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見表1)。

2.2 各組研究對象外周血中TL1A mRNA水平的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SA組、UA組、AMI組患者外周血中TL1AmRNA水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，UA組、AMI組患者與SA組患者相比外周血中TL1A mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。

表1 各組研究對象臨床資料的比較Table 1 Clinical characteristics of patients in different groups

表2 各組研究對象外周血中TL1A mRNA和血漿TLIA水平的比較(±s)Table 2 Comparison of the levels of TL1A mRNA in the peripheral plasma TL1A levels blood among different groups(±s)

表2 各組研究對象外周血中TL1A mRNA和血漿TLIA水平的比較(±s)Table 2 Comparison of the levels of TL1A mRNA in the peripheral plasma TL1A levels blood among different groups(±s)

與對照組相比，*P＜0.05，與SA組相比，△P＜0.05

組別 n TL1A mRNA TL1A/(ng/ml)對照組35 0.28±0.09 0.82±0.21 SA組 35 0.35±0.10* 0.98±0.22*UA組 30 0.43±0.11＊△ 1.22±0.24＊△AMI組 25 0.53±0.13＊△ 1.41±0.29＊△

2.3 各組研究對象血漿中TL1A水平的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SA組、UA組、AMI組患者血漿中TL1A水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，UA組、AMI組患者與SA組患者相比血漿中TL1A水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。

3 討論

冠心病主要由動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引起，AS發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未完全清楚，目前認(rèn)為AS是一種慢性炎癥性疾病，多種炎性細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞參與了AS的發(fā)生發(fā)展過程，我們前期研究證實(shí)Th1/Th2細(xì)胞失衡以及Th17細(xì)胞均在粥樣斑塊的形成及斑塊的不穩(wěn)定性中起重要作用［7-9］。

TL1A是新近發(fā)現(xiàn)的屬于腫瘤壞死因子超家族成員15的新型細(xì)胞因子，其基因定位于染色體9q32，由4個外顯子組成，編碼含有251個氨基酸的蛋白質(zhì)。TL1A在內(nèi)皮細(xì)胞尤其在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞也少量表達(dá)，激活狀態(tài)下表達(dá)顯著增多。TL1A不僅可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，而且研究表明TL1A可以與死亡受體3結(jié)合，為T淋巴細(xì)胞活化提供第二刺激信號，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞趨化至炎性部位，同時TL1A具有獨(dú)特的Th1細(xì)胞極化作用，促進(jìn)白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)、IFN-γ 等炎性因子的釋放［4-6］。此外TL1A能夠增強(qiáng)Th17細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)其釋放前炎癥因子IL-17［10-13］。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)TL1A在人頸動脈粥樣斑塊中高表達(dá)，TL1A可以誘導(dǎo)細(xì)胞高表達(dá)促炎性因子和趨化因子，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而降低斑塊的穩(wěn)定性［14-17］。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同類型的冠心病患者外周血中TL1A mRNA水平及血漿TL1A水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，AMI、UA組患者與SA組患者相比外周血中TL1A mRNA水平及血漿TL1A水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。綜合目前關(guān)于冠心病及TL1A的研究結(jié)果，我們推測冠心病患者體內(nèi)TL1A水平升高，可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞趨化，活化T淋巴細(xì)胞，分泌炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成。同時AMI及UA患者體內(nèi)TL1A水平明顯升高，在促進(jìn)炎癥因子釋放的同時，可能促進(jìn)了Th1及Th17細(xì)胞極化，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶，降低斑塊的穩(wěn)定性，導(dǎo)致AMI及UA的發(fā)生。

綜上所述，冠心病患者外周血中TL1A水平增高，可能通過炎性反應(yīng)和Th1及Th17細(xì)胞極化，參與了粥樣斑塊的形成，導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定性，但TL1A水平增高及具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，這對預(yù)防和治療冠心病尤其是急性冠脈綜合征具有一定的指導(dǎo)意義。

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