CD163受體在PRRSV 入侵過程中的作用機制

宋曉暉，王淑娟，張衍海，馮春燕，李秀峰

（1.中國動物疫病預防控制中心，北京100125；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島266032；3.中國檢驗檢疫科學研究院 動物檢驗檢疫研究所，北京10029）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）具有非常嚴格的細胞嗜性，這種嗜性很大程度上取決于細胞表面是否存在特異性的病毒受體。目前已鑒定到的PRRSV受體有硫酸乙酰肝素（heparin sulfate，HS）、唾液酸黏附素（sialoadhesin，Sn），CD163、波形蛋白受體（vimentin）等。PRRSV入侵細胞過程中，首先與細胞表面的硫酸乙酰肝素結(jié)合，起始入侵過程，接著結(jié)合唾液酸黏附素，使病毒和細胞的結(jié)合更加穩(wěn)定。進一步通過鈣黏素介導的內(nèi)吞作用介導病毒-受體復合物進入胞內(nèi)。在吸附-侵入末期，病毒同宿主細胞CD163相互作用，釋放基因組，開啟復制過程。在PRRSV侵入感染宿主細胞過程中Sn和CD163是最主要結(jié)合和內(nèi)化受體，因此成為PRRSV入侵機制研究進展的熱點。本文對CD163在PRRSV入侵過程中作用機制的研究進展進行總結(jié)，為進一步闡明病毒的入侵機制，尋找新的抗病毒靶位點等研究提供一定的理論基礎。

1 CD163的結(jié)構(gòu)和功能

CD163屬于富含半胱氨酸的清道夫受體（scavenger receptor cysteine-rich，SRCR）超家族成員。根據(jù)每個SRCR區(qū)域半胱氨酸殘基數(shù)量，清道夫受體超家族又分為A群和B群。A群受體的典型特征是每個SRCR由2個外顯子編碼，為6個半胱氨酸殘基，而B群受體的每個SRCR由一個外顯子編碼，為6個到9個半胱氨酸殘基。根據(jù)是否含有除SRCR外的其他胞外區(qū)，將B群受體又分成2個亞群。CD163屬于B群清道夫受體的第1亞群［1］。CD163分子只在單核細胞和巨噬細胞上表達，在成熟巨噬細胞豐富的肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓細胞中高表達。新鮮分離的外周血單核細胞中CD163分子表達水平很低，在細胞進一步分化為巨噬細胞后，其表達量增加。腫瘤壞死因子（TNF），干擾素γ，脂多糖（LPS），轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等能下調(diào) CD163的表達，相反，類固醇，白細胞介素6（IL-6），白細胞介素10（IL-10）等能促進 CD163表達［2］。

首次鑒定到CD163的時候，就推測CD163可能在炎癥反應中發(fā)揮作用，但一直沒有找到與其相互作用的配體。直到2001年，Kristiansen M 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，CD163分子與血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復合物（Hemoglobin-haptoglobin，Hb-Hp）相互作用，在抗炎、抗氧化過程中發(fā)揮作用。游離Hb被Hp捕獲后，形成的Hb-Hp復合體會呈現(xiàn)出新的抗原決定簇，結(jié)合CD163分子。最近，丹麥奧胡斯大學的科學家們成功的解析了Hb-Hp復合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)從復合物的遠端表面突出的結(jié)合珠蛋白環(huán)正是CD163的結(jié)合位點［4］。CD163結(jié)合 Hb-Hp后，啟動細胞內(nèi)信號通路，導致IL-10釋放。隨后，CD163-Hb-Hp復合物內(nèi)化進入巨噬細胞，在初級內(nèi)體中，CD163解離，重新回到細胞膜，而Hb-Hp進入溶酶體，在其中被血紅素氧合酶（heine oxygenase，HO）降解為膽綠素、Fe2＋和CO。在整個結(jié)合過程中產(chǎn)生的IL-10和CO，能夠產(chǎn)生非常強的抗炎效果［5］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑（tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK）能夠與CD163特異性的結(jié)合。TWEAK作為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族的新成員之一，最初是從人扁桃體和胎肝cDNA文庫中篩選出，因其能微弱誘導腫瘤細胞凋亡故將其命名為TWEAK。TWEAK可以與細胞表面的特異性受體Fn14結(jié)合，發(fā)揮誘導細胞凋亡，促進血管生成、炎癥反應及細胞增殖、遷移、分化等一系列生物學活性。研究發(fā)現(xiàn)，CD163分子作為TWEAK的特異性受體，同TWEAK相結(jié)合后，能抑制TWEAK的自嗜活性［6-7］。

CD163不僅同內(nèi)源性配體結(jié)合，調(diào)節(jié)炎癥反應，還能夠同外源性配體如細菌、病毒結(jié)合。CD163在細胞表面表達，能夠有效地結(jié)合細菌。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性菌和革蘭陽性菌都能夠同CD163結(jié)合。目前已經(jīng)鑒定到兩個主要的結(jié)合點，一個是在CD163的第2個SRCR中的FRIEIKFQGRW功能域，為主要結(jié)合位點，另一個是在第3個SRCR中的GRLEVRFQGEW功能域，其結(jié)合效率低于第一個結(jié)合位點。CD163同細菌的結(jié)合后，會促進吞噬細胞分 泌 TNF-α、IL-1β、IL-6等前 炎 癥 細 胞 因 子［8］。除了細菌，CD163在病毒感染過程中也發(fā)揮非常重要的作用。已經(jīng)證明CD163是非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）以及PRRSV入侵宿主細胞的重要受體分子［9-10］。

2 CD163在PRRSV感染中的作用

Calcert J G等［11］首次報道CD163為PRRSV入侵細胞的受體之一。他們在篩選原代豬肺泡巨噬細胞cDNA表達文庫時發(fā)現(xiàn)，CD163能夠使PRRSV非敏感細胞系變成PRRSV敏感細胞系。將豬、犬、老鼠、人以及非洲綠猴來源的CD163轉(zhuǎn)染到幼倉鼠腎傳代細胞（BHK-21）、豬腎細胞、貓腎傳代細胞系（NLFK）等PRRSV非敏感細胞系后，這些細胞能夠允許PRRSV的復制和增殖。Van G H等［10］發(fā)現(xiàn)類人猿的CD163在PRRSV感染猴腎細胞（MARC-145）中起十分關鍵的作用，并且用CD163抗體與MARC-145細胞孵育，能有效抑制病毒感染。Patton J B等［12］利用流式細胞術，發(fā)現(xiàn)CD163的表達同PRRSV的復制水平呈正相關。用TPA和LPS等抗炎因子處理豬肺泡巨噬細胞（PAM）和單核巨噬細胞（MDM）降低CD163表達水平，病毒的復制水平也會降低。相反如果用IL-10等上調(diào)CD163表達的分子刺激細胞，病毒感染水平相應增加。原代PAM細胞是PRRSV敏感細胞，通過在PAM細胞中轉(zhuǎn)入SV40的大T抗原，能夠獲得永生化PAM細胞系3D4／21，該永生化的細胞系失去PRRSV的敏感表型，并且在其中PAM細胞中檢測不到 CD163的表達［13］。Lee Y J等［14］發(fā)現(xiàn)把CD163基因轉(zhuǎn)入到永生化PAM細胞系中，能使這些細胞再次獲得對PRRSV的敏感性。并且，在福爾馬林固定的細胞表面能夠檢測到穩(wěn)定表達的CD163。同時用免疫印跡方法，在細胞裂解物中能夠發(fā)現(xiàn)大量表達的CD163。Wang L等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在體外PRRSV不能感染不表達Sn和CD163的外周血單核細胞，但用豬血清以及L929培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞后，96h內(nèi)細胞CD163的表達水平上升50%，同時PRRSV也能夠在這些細胞中復制，并且復制水平與在PAM中的復制水平相當。這些試驗結(jié)果都表明了CD163分子在病毒的入侵、感染過程中發(fā)揮重要的作用。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，CD163在病毒脫衣殼和基因組釋放過程中起關鍵性作用。將CD163特異性抗體與肺泡巨噬細胞37℃孵育后，PRRSV感染被抑制。但如果在4℃孵育則對感染沒有影響，這說明CD163并不參與PRRSV吸附過程，而是參與病毒基因組復制過程。瞬時表達CD163，能夠使非敏感細胞變成敏感細胞系，但內(nèi)化的病毒非常少，PRRSV只有在部分細胞中有效復制。瞬時表達Sn，能觀察到大量病毒發(fā)生內(nèi)化，但復制增殖的病毒很少。同時表達CD163和Sn能夠使病毒復制水平大大增加，超過單獨表達CD163［10］。這說明Sn作為病毒結(jié)合和內(nèi)吞的受體，而CD163是病毒復制增殖的關鍵性受體［16］。

3 與CD163結(jié)合的PRRSV囊膜蛋白

在PRRSV囊膜上，有糖蛋白GP5、GP2a、GP3、GP4以及非糖基化M蛋白和2b蛋白。GP5在病毒囊膜表面數(shù)量最多，被稱為大囊膜蛋白，GP2a、GP3、GP4等蛋白數(shù)量少被稱為小囊膜蛋白。這些糖蛋白在病毒組裝、病毒同細胞表面受體相互作用以及病毒釋放過程中都發(fā)揮著重要作用［17］。由于GP5與M蛋白形成聚體，并且在囊膜上數(shù)量最多，因此，最早認為GP5和M蛋白在病毒同受體相互作用過程中發(fā)揮重要作用。但對馬動脈炎病毒（Equine viral arteritis，EAV）的相關研究發(fā)現(xiàn)，將GP5和M蛋白的胞外區(qū)域用PRRSV或者LDV的相應胞外區(qū)域替換，并不改變病毒的細胞嗜性，說明GP5不是結(jié)合CD163的特異性受體［18］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，小囊膜蛋白在同CD163受體相互作用過程中發(fā)揮重要作用。在BHK-21中共表達 GP2a、GP3、GP4或GP5及CD163子，表達產(chǎn)物在細胞裂解和免疫共沉淀后，用CD163特異性抗體雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD163特異性抗體除了結(jié)合CD163，還能結(jié)合GP2a和GP4。進一步用特異性單抗檢測發(fā)現(xiàn)，單獨表達的GP2a或者GP4不能結(jié)合CD163分子，兩者共同作用才能結(jié)合CD163［19］。這說明在PRRSV與CD163相互作用的過程中，GP2a和GP4是關鍵的結(jié)合分子。最近通過雙分子熒光互補（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）分析技術發(fā)現(xiàn)，GP4是最主要的CD163的結(jié)合分子［20］。GP4是Ⅰ型膜蛋白，但C末端沒有疏水尾巴，突變GP4上1個或者2個糖基化位點，對于PRRSV復制沒有影響，同時突變3個到4個，病毒則不能復制，糖基化并不影響GP4同CD163的結(jié)合［21］。最近研究發(fā)現(xiàn)GP4為脂錨蛋白（lipid-anchored membrane protein），能夠同CD163共沉淀在細胞膜的脂筏（lipid rafts）上［22-23］。

除了GP2a和GP4的特異性結(jié)合，其他的糖蛋白GP5、GP3以及非糖蛋白M在同受體的相互作用過程中也可能發(fā)揮非特異性結(jié)合的作用。在感染細胞中，PRRSV囊膜蛋白形成復合體后，才能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體運輸，最后到達質(zhì)膜，裝配到病毒粒子表面［24］。因此，CD163與PRRSV的結(jié)合過程，很可能是囊膜蛋白復合體與CD163的相互作用過程。冷凍電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病毒囊膜表面看起來非常的光滑，雖然囊膜表面GP5和M蛋白數(shù)量多，但是由于形成的聚體不夠大，因此不能觀察到。但是在光滑的病毒離子表面能夠觀察到一些大的凸起，這些大的凸起非常像大的蛋白復合物的聚體。因此推測在病毒囊膜表面，GP3-GP2a-GP4與GP5-M形成大的蛋白聚體，在病毒與其細胞受體相互結(jié)合過程中發(fā)揮作用。其中GP4一方面調(diào)節(jié)小結(jié)構(gòu)蛋白復合體GP3-GP2a-GP4與大結(jié)構(gòu)蛋白GP5結(jié)合，另一方面與GP2a相互作用結(jié)合CD163，促進病毒基因組的釋放。其他相關研究發(fā)現(xiàn)GP5-M復合物能夠非特異性的結(jié)合肝素樣受體。因此推測很可能在大蛋白復合體中GP5-M與CD163分子之間也存在非特異性結(jié)合。除了糖蛋白，囊膜表面的2b和M蛋白在病毒與受體相互作用過程中也發(fā)揮一定的作用，相關的研究也正在開展。與病毒相互作用的受體蛋白或者相互作用的關鍵區(qū)域能夠誘導機體產(chǎn)生高水平的針對性中和抗體，一直以來是疫苗研制或者治療的理想靶標。GP2a和GP4帶有CD163的受體結(jié)合區(qū)域，因此是PRRSV疫苗研制和治療的非常理想的分子［25］。

4 參與PRRSV感染的CD163的功能域

CD163分子由N端9個SRCR區(qū)域，一個24個氨基酸組成的跨膜區(qū)以及C端一個短的胞漿尾組成。胞漿尾與蛋白酶C以及肌酸激酶具有相同的磷酸化序列，其中帶有內(nèi)化功能域Yxxφ。研究發(fā)現(xiàn)胞漿尾不僅影響PRRSV對細胞的敏感性，還影響病毒在細胞中的復制水平［26］。CD163還有2個脯氨酸絲氨酸蘇氨酸富集區(qū)（PST），一個在第6個和第7個SRCR之間，另外一個在SRCR9與跨膜區(qū)域之間［26］。目前通過定點突變以及嵌合突變的方法，鑒定到了CD163分子與PRRSV相結(jié)合的關鍵位點。定點突變研究發(fā)現(xiàn)將CD163的胞漿內(nèi)序列突變并不影響其受體活性，而如果將其胞外域全部缺失，CD163完全喪失其活性，PRRSV病毒不能夠在這樣的細胞中復制。說明CD163的關鍵功能區(qū)都在胞外［27］。與CD163同屬于清道夫受體超家族B群的CD163-L1與CD163的結(jié)構(gòu)非常相似，但是在PRRSV病毒復制過程中不能發(fā)揮受體作用。通過利用CD163-L1的相關區(qū)域?qū)D163進行的嵌合突變發(fā)現(xiàn)，SRCR5是CD163與PRRSV相互作用的關鍵功能域。在用CD163-L1的SRCR5替代CD163的相關區(qū)域后，PRRSV在突變細胞中不能復制、增殖［27］。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的M2BP的晶體結(jié)構(gòu)，通過對人CD163的9個SRCR序列比較，推測出SRCR5中第5和第6個環(huán)是主要的結(jié)合區(qū)域，而SRCR其他區(qū)域則起到結(jié)合腳手架的作用。除了SRCR5，研究發(fā)現(xiàn)，SRCR6、PST1和PST2區(qū)域雖然對PRRSV復制沒有決定性作用，但是對病毒復制量有一定的影響［28］。胞外 N 端的 SRCR1、SRCR2、SRCR3不影響CD163與PRRSV結(jié)合的受體活性。Hb-Hp復合物能夠與CD163相結(jié)合，結(jié)合位點正好位于SRCR2，SRCR3，因此對CD163與PRRSV的結(jié)合沒有作用［9］。CD163作為不同病毒的受體，其關鍵功能區(qū)域也不同。研究發(fā)現(xiàn)單克隆抗體2A10能夠抑制ASFV感染以及病毒粒子與巨噬細胞結(jié)合，并且結(jié)合位點恰好位于SRCR1-SRCR3之間。因此單克隆抗體2A10能夠抑制ASF病毒感染，但是不能抑制PRRSV感染。因為CD163與ASFV結(jié)合的關鍵性位點正好位于SRCR1-SRCR3內(nèi)［29］。

總之，隨著對CD163與PRRSV糖蛋白相互作用研究的深入，已經(jīng)提出了PRRSV在細胞膜上與CD163相互作用的模型，并且初步描繪了病毒在細胞中復制的過程。但是，作為PRRSV細胞內(nèi)復制的重要受體，CD163與病毒的相互作用啟動了一連串動力學過程，目前對這個過程了解還很少，特別是CD163分子參與的病毒基因組的釋放過程的整個機理還是不清楚，因此還需要大量的基礎研究才能揭開PRRSV進入細胞后復制的全貌。

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