尿液蛋白質(zhì)組學(xué)

趙國順，趙興緒，張 勇，武小虎，劉姍姍，陶金忠

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

由于尿液具有收集簡單、非侵入性等特點(diǎn)，早在1927年，人們就利用從孕婦尿液中發(fā)現(xiàn)的β人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）發(fā)明了早孕測試紙，這是人類對尿液蛋白質(zhì)的早期利用。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展，尿液蛋白質(zhì)組學(xué)也得到了迅速的發(fā)展，這讓尿液蛋白質(zhì)的檢測，尤其是尿液中生物標(biāo)記物的檢測成為尿液蛋白質(zhì)組的研究熱點(diǎn)。一般來說，生物標(biāo)記物是指可以在活體中檢測到的具有特征性的可以指示生理功能或結(jié)構(gòu)改變的生物分子，蛋白質(zhì)也是其中的一種。

1 正常尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展歷程與現(xiàn)狀

1996年，Marshall T等[1]首次運(yùn)用雙向電泳（two－dimensional electrophoresis，2DE）技術(shù)分離尿液中蛋白質(zhì)，建立了正常人尿液蛋白質(zhì)組2DE圖譜并提出了“尿蛋白質(zhì)組學(xué)”（urinary proteomics）的概念，即利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)高通量、系統(tǒng)性地分析和鑒定尿液中的所有蛋白質(zhì)分子并研究其生物學(xué)功能。盡管這項(xiàng)試驗(yàn)沒有做后續(xù)的研究，但開啟了人們對尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究歷程。1997年，Heine G等[2]鑒定出正常人尿液中的白蛋白、載脂蛋白、免疫球蛋白、膠原蛋白等34個高豐度蛋白質(zhì)。2002年，Thongboonkerd V等[3]分離鑒定出正常人尿液中的67種蛋白質(zhì)及其亞型。但由于尿液含有大量的高豐度蛋白，這在很大程度上影響了尿液蛋白質(zhì)組的進(jìn)一步研究。2004年，Pieper R等[4]采用免疫親和扣除色譜技術(shù)（immunoaffinity subtraction chromatography）去除尿液中高豐度蛋白，用雙向電泳分離出約1400個蛋白點(diǎn)，用質(zhì)譜技術(shù)檢測其中420個點(diǎn)，鑒定出150種蛋白質(zhì)。2006年，Adachi J等[5]應(yīng)用一維凝膠電泳與液相色譜配合線性離子阱－傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（linear ion trap－Fourier transform mass spectrometer，LTQ－FT）技術(shù)和LTQ－Orbitrap電場軌道阱回旋共振組合質(zhì)譜（linear ion trap－orbitrap mass spectrometer，LTQOrbitrap）技術(shù)從正常人的尿樣中鑒定出1534種蛋白，其中大多數(shù)是膜蛋白。2009年，Alex K等[6]通過超速離心、凝膠電泳、離子交換、反相色譜等方法分級分離與提取尿液中的蛋白質(zhì)，用LTQ－Orbitrap質(zhì)譜與液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC－MS／MS）技術(shù)鑒定出2362種蛋白質(zhì)，新發(fā)現(xiàn)1000多種，其中包括腎小球?yàn)V過細(xì)胞因子、脫落的細(xì)胞表面因子、腎臟與泌尿道產(chǎn)生的轉(zhuǎn)運(yùn)體與結(jié)構(gòu)蛋白等，這些蛋白涉及到了25種常見病與500多種罕見病。近年來，Kim K H等[7]用改進(jìn)的等電聚焦與非對稱流場流（isoelec－tric focusing－asymmetrical flow field－flow fractionation，IEF－AF4）分離，用納流液相色譜－電離－串聯(lián)質(zhì)譜（nanoflow liquid chromatography－electrospray ionization－tandem mass spectrometry，nLC－ESI－MSMS）技術(shù)純化并鑒定出尿液中的245種蛋白質(zhì)，其中新發(fā)現(xiàn)110種蛋白質(zhì)。

尿液中含有由腎臟上皮細(xì)胞分泌的小泡－外核體（exosomes），其反映著疾病病理機(jī)制的細(xì)胞進(jìn)程，其中含有蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和信號分子，多數(shù)蛋白與疾病相關(guān)[8]。研究外核體蛋白質(zhì)組不僅有助于認(rèn)識外核體在腎臟中的功能，而且有助于尋找反映疾病發(fā)病機(jī)理的生物標(biāo)志物[9]。2004年，Pisitkun T等[10]從尿液外核體內(nèi)分離出295種蛋白質(zhì)，其中包括多種遺傳病的生物標(biāo)記物。2009年，Gonzales PA等[11]從人尿液外核體內(nèi)檢測到1412種蛋白質(zhì)，其中可確定的有1132種，新發(fā)現(xiàn)927種，有177種與OMIM數(shù)據(jù)庫發(fā)布的數(shù)據(jù)相匹配。2011年，Hiemstra TF等[12]在去除尿調(diào)蛋白后，用質(zhì)譜技術(shù)檢測到外核體內(nèi)的288種蛋白質(zhì)。2012年，Wang Z等[13]用多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（multidimensional protein identification technology，Mud－PIT）從9個人的尿液外核體中分離到3280種蛋白質(zhì)，相互之間的重復(fù)率是31%，從每個人的尿液中可檢測到1000多種蛋白。

2 與生理和病理相關(guān)的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究

腎小球主要依賴蛋白質(zhì)分子量大小與帶電量的多少選擇流經(jīng)腎臟的血液蛋白質(zhì)被濾過還是被重吸收，其中將有30%的蛋白質(zhì)被濾過[14]。無論生理狀態(tài)改變還是病理變化都可以影響尿液內(nèi)的蛋白質(zhì)，通過檢測這些蛋白含量與成分的改變，就可以了解機(jī)體的發(fā)育和生理代謝以及疾病的發(fā)生、發(fā)展及愈后。

2.1 尿液中的血液蛋白質(zhì)

腎小球每天可以產(chǎn)生150L～180L的超濾液，而只有不到1%的超濾液形成尿液排出[15]，尿液中除超濾液外還有腎臟分泌物。尿液中有70%的蛋白質(zhì)來源于腎臟，其余30%的蛋白質(zhì)來源于血液[16]。通過血液與尿液蛋白質(zhì)組的比較可以區(qū)分蛋白質(zhì)的來源，確定某種蛋白質(zhì)是來源于泌尿系統(tǒng)還是其他系統(tǒng)。

Jia L等[17]將腎臟比作黑盒，把血液中的2611種與尿液中的1522種高度可信的蛋白質(zhì)基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分為3組數(shù)據(jù)庫，即血液蛋白質(zhì)組、尿液蛋白質(zhì)組、血液－尿液蛋白質(zhì)組，通過生物信息學(xué)比較，鑒定出腎臟濾過的蛋白質(zhì)及腎臟分泌的和排出的蛋白質(zhì)。這為認(rèn)識尿液蛋白質(zhì)組的構(gòu)成特點(diǎn)提供了一種新思路。

Candiano G等[18]用雙向電泳從尿液中檢測到1118個高重復(fù)性點(diǎn)，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定出82種蛋白質(zhì)及其亞型，其中30種也存在于血液中。

2.2 尿液中與生殖和發(fā)育相關(guān)的蛋白

Castagna A等[19]用雙向電泳技術(shù)研究了與女性生理激素周期相關(guān)的尿液蛋白質(zhì)。選取女性月經(jīng)周期的中期（G1）、黃體期（G2）還有藥物避孕2個月（G3）這三個階段的尿液，通過4組試驗(yàn)（G1vs.G2、G1vs.G3、G2vs.G3和 G（G1＋G2）vs.G3）的比較發(fā)現(xiàn)了115個隨月經(jīng)周期而變化的蛋白質(zhì)，并鑒定出一種新的雌激素（孕酮）藥物。

Lee RS等[20]運(yùn)用納升－電噴霧－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（nano－ESI－LC－MS／MS）技術(shù)比較了不同發(fā)育階段鼠的尿液蛋白質(zhì)。將小鼠按照出生后的天數(shù)分為出生后1d（P1），出生后3d（P3），出生后7d（P7），出生后14d（P14）和出生后30d以上（P30），通過比較這5個階段的尿液蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了15種與幼鼠的細(xì)胞黏連、結(jié)構(gòu)、增生和分化有關(guān)的蛋白質(zhì)，其中黏連蛋白、E－鈣黏著蛋白和α1膠原蛋白出現(xiàn)在P1－P14期；Delta－like出現(xiàn)在 P1－P7；上皮生長因子出現(xiàn)在P7－P30；還發(fā)現(xiàn)有30種成年鼠分泌的蛋白質(zhì)，其中有13種來源于前列腺和精囊腺，8種是由前列腺分泌，1種由精囊腺分泌，還有1種由mRNA編碼的蛋白質(zhì)在兩種器官中都存在，其中由前列腺分泌的Probasin與雄性動物成熟有關(guān)。這表明在產(chǎn)后嚙齒類動物的發(fā)育中，尿液蛋白質(zhì)組差異較大。

Charlton J R等[21]運(yùn)用抗體芯片和ELISA技術(shù)分別鑒定早產(chǎn)兒（33周～35周出生）和足月兒（38周～40周出生）從出生到12個月的尿液蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在出生時，早產(chǎn)兒尿液中的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白－1、－2、－6，巨噬細(xì)胞趨化蛋白－1，CD14和Siglec－5的含量比足月兒高，但在2～6個月內(nèi)會降到同一水平，而許多足月兒尿液中標(biāo)記物在1年內(nèi)保持穩(wěn)定。因此，妊娠和產(chǎn)后的時間對尿液蛋白質(zhì)也有影響。

2.3 尿液中與代謝相關(guān)的蛋白

Kohler M等[22]用雙向電泳聯(lián)用納升超高效液相色譜－LTQ Orbitrap 質(zhì)譜（nano－UPLC－LTQ Orbitrap MS）技術(shù)研究了鍛煉對尿液中蛋白質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鍛煉者體內(nèi)的血色素結(jié)合蛋白、牛血清白蛋白、血清類黏蛋白1、轉(zhuǎn)鐵蛋白和碳酸酐酶1表達(dá)上調(diào)。這為運(yùn)動員在訓(xùn)練和比賽中建立生理監(jiān)測系統(tǒng)，也可以作為興奮劑的補(bǔ)充檢測提供了科學(xué)依據(jù)。

Airoldi L等[23]運(yùn)用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)比較了健康的吸煙者和不吸煙者的尿液蛋白組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在吸煙者體內(nèi)3種炎性蛋白（S100A8、間－α－胰蛋白酶抑制劑重鏈4、CD59）和兩種胰－α淀粉酶表達(dá)上調(diào)，鋅－α2糖蛋白表達(dá)下調(diào)，其中鋅－α2糖蛋白和胰－α淀粉酶含量的變化可能會誘發(fā)疾病，因此可以作為由吸煙引起的疾病的生物標(biāo)記物。

2.4 尿液中的疾病蛋白標(biāo)記物

最新數(shù)據(jù)的人類尿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫（human urinary database，http：／／mosaiques－diagnostics.de／diapatpcms／mosaiquescms／front＿content.php？idcat＝257）收錄了13020個尿液樣品。其中發(fā)現(xiàn)的人的生物標(biāo)記物涉及的疾病主要有移植相關(guān)疾?。ㄔ煅杉?xì)胞移植、腎移植、腎移植、肝移植等），泌尿道疾?。ò螂纵斈蚬苣媪鳌⑤斈蚬苓B接部梗阻、腎臟疾病、膜性腎小球腎炎、腎結(jié)石、IgA腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化、糖尿病腎病、多囊性腎病、急性腎臟損傷、范可尼綜合征、微小病變性腎病等），生殖道疾?。夹郧傲邢僭錾Y、先兆子癇、多囊卵巢綜合征等），腦血管疾?。}管炎、血栓形成、高血壓、心臟衰竭、1型與2型糖尿病、冠狀動脈疾病等），腫瘤（嗜鉻細(xì)胞瘤、卡波西氏肉瘤、膀胱癌、腎癌、前列腺上皮內(nèi)瘤變、前列腺癌、法布里病、動脈瘤、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌等），免疫性疾?。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、人類免疫缺陷病毒、過敏性紫癜等），神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及其他一些疾?。ǚ窝住⒈透窝?、膽道閉鎖、老年癡呆癥、目盲、重癥監(jiān)護(hù)病房患者）等。而在這些疾病中，每一種疾病相關(guān)的蛋白標(biāo)記物少則幾種，多則一千多種，而這些標(biāo)記物并不特異性的代表某一種疾病，如Tetaz R等[24]從腎移植慢性移植腎功能障礙的18個生物標(biāo)記物中篩選出了一種診斷腎移植慢性移植腎功能障礙的蛋白，它的敏感性和特異性也只有93%和65%。

3 尿液蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)共享

目前，國內(nèi)外關(guān)于病理情況下尿液中蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)已經(jīng)非常豐富，但由于個體間以及個體內(nèi)存在差異；早期小樣本試驗(yàn)須經(jīng)過大樣本的驗(yàn)證才能確定；再者由于試驗(yàn)條件所限，單個研究機(jī)構(gòu)研究的樣本數(shù)和疾病種類都比較有限，很難解決生理和疾病相關(guān)標(biāo)志物的可信度和特異性的問題，因此需要建立數(shù)據(jù)共享平臺。如上面提及的人類尿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，還有尿液蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)庫（Urinary Protein Biomarker Database，http：／／122.70.220.102／biomarker／），它是基于PubMed數(shù)據(jù)庫公布的可以用于標(biāo)記疾病的蛋白質(zhì)建立的，其中涉及到人類的10種癌癥，31種泌尿外科疾病和15種非泌尿道疾?。簧婕皠游锏?1種泌尿道疾病和4種非泌尿道疾病。再有尿液外核體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Urinary Exosome Protein Database，http：／／dir.nhlbi.nih.gov／papers／lkem／exosome／），它是基于腎臟與電解質(zhì)代謝實(shí)驗(yàn)室（Laboratory of Kidney and Electrolyte Metabolism，NHLBI）用兩種質(zhì)譜方法鑒定的外核體蛋白質(zhì)而建立的，其中包括了1600中蛋白質(zhì)。這些數(shù)據(jù)庫的建立不僅可以解決數(shù)據(jù)的可靠性的問題，通過數(shù)據(jù)的比較還可以確定某種疾病的特異性蛋白。

4 挑戰(zhàn)與展望

隨著許多的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在尿液蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用，在尿液中檢測到的蛋白質(zhì)也越來越多，尿液蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫也越來越豐富。目前，尿液蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中包含的蛋白質(zhì)已經(jīng)達(dá)到幾千種，尿液中的大多數(shù)蛋白質(zhì)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。正常尿液中的蛋白質(zhì)也與大多數(shù)疾病有關(guān)，生理狀態(tài)的改變和病理狀態(tài)的變化都會影響尿液蛋白質(zhì)。通過正常尿液與生理或病理狀態(tài)的比較，篩選可以標(biāo)記某種生理狀態(tài)或某種疾病的蛋白。因此，一個正常狀態(tài)下的尿液蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫是非常必要的。雖然不能建立每一個個體實(shí)時的、動態(tài)性的尿液蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，但是首先建立一個基本的共同尿液蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是可行的，這些蛋白質(zhì)雖然不可能與所有的疾病或生理狀態(tài)的改變相關(guān)聯(lián)，但可以顯示大多數(shù)疾病或生理狀態(tài)的變化。

大量的疾病標(biāo)記物表明檢測疾病狀態(tài)的生物標(biāo)記物已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段，雖然生物標(biāo)記物在“證據(jù)原則”下的研究是可行的，但是在大樣本的研究中可以被確定的的生物標(biāo)記物卻很少。目前，檢測標(biāo)記生理狀態(tài)變化的蛋白標(biāo)記物的研究較少，但是遲早都會面臨臨床應(yīng)用這一難關(guān)。Truong M等[25]基于Pubmed和Web of Science數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計(jì)了在尿液中檢測到的前列腺癌在基因組學(xué)、實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)、轉(zhuǎn)錄物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)中的生物標(biāo)記物，結(jié)果表明每個單一學(xué)科都沒有一種能夠特異標(biāo)記前列腺癌的生物標(biāo)記物。動物機(jī)體作為一個完整的有機(jī)體，不僅僅包括蛋白質(zhì)一種物質(zhì)，而且試驗(yàn)已經(jīng)證明一個生物分子不能完全標(biāo)記一種疾病，一組鑲嵌式的標(biāo)記物將會更好的適用于疾病[26]，這估計(jì)也需要更多生物學(xué)科的整合，如“－omics”。

正如Amos Bairoch所說“近10年來，許多蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)都是垃圾”[27]。由于不同實(shí)驗(yàn)室與平臺之間、不同個體之間、同一個體的不同時間段、不同性別與不同年齡之間[28]甚至不同地域之間的尿液蛋白質(zhì)都可能存在著差異；另外，年齡、性別、保存時間、反復(fù)凍融、保存溫度[29]和是否添加蛋白酶抑制劑[30]也對尿液蛋白質(zhì)的研究結(jié)果有影響，這些都是尿液蛋白質(zhì)組研究發(fā)展需要克服難題，需要建立數(shù)據(jù)共享平臺，協(xié)調(diào)各種研究工作，減少大量的重復(fù)工作，確保研究的可靠性，盡可能的將真實(shí)的數(shù)據(jù)應(yīng)用于臨床實(shí)際，這將是一項(xiàng)很艱巨的工作。目前，人類腎臟與尿液蛋白質(zhì)組計(jì)劃（http：／／www.hkupp.org／）、歐洲腎臟與尿液蛋白質(zhì)（http：／／www.eurokup.org／）還有上面提及的幾個組織等已經(jīng)致力于這方面的工作。

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