江西部分地區(qū)豬痘病毒PCR檢測及P35基因的分析

鄧舜洲，蔣新華，冷 闖，朱芝秀，鄔向東，戴益民，張文波

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

豬痘病毒（Swinepox virus，SWPV）是痘病毒科（Poxviridae）脊椎動物亞科（Chordopoxvirinae，ChPV）豬痘病毒屬（Suipoxvirus）的唯一成員［1］，以引起豬的發(fā)熱，表皮損傷，形成痘疹和結(jié)痂為特征；主要危害4月齡以內(nèi)的仔豬，發(fā)病率可達100%，成年豬呈溫和性感染，而且其發(fā)病率與飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)［2］。SWPV具有嚴(yán)格的宿主特異性，豬是該病毒的唯一自然感染宿主。1842年Spinola首次在歐洲發(fā)現(xiàn)本病并報道，1960年Kasza L等［3］利用PK-15細(xì)胞分離到豬痘病毒；2011年Maria M L等［4］報道巴西某豬場的保育豬暴發(fā)豬痘。目前，豬痘呈世界性分布［2］。

由于豬痘對養(yǎng)豬業(yè)造成的直接損失較小，雖然也有豬痘病毒感染引起流產(chǎn)或死胎等繁殖障礙的報道［5］，但豬痘臨床上主要表現(xiàn)部分豬皮膚出現(xiàn)不同程度的損傷（如水皰、痘痂、局部潰爛等），大部分感染豬能自行康復(fù)，因此，豬痘防控工作常被畜牧獸醫(yī)工作者忽視。豬痘病毒的研究主要集中于豬痘病毒作為表達載體［6-8］。國內(nèi)也有豬痘病例報道，但僅限于臨床診斷［9-11］，未見從分子生物學(xué)角度進行豬痘流行病學(xué)調(diào)查的報道。

本研究根據(jù)NCBI登錄的SWPV（AF410153.1）P35保守基因序列，設(shè)計并合成一對引物，從江西省36個規(guī)模化豬場采集疑似豬痘病豬的皮膚痘痂，提取DNA后進行PCR檢測，了解江西省豬群中豬痘病毒的感染情況。在此基礎(chǔ)上，對江西省部分地區(qū)豬痘病毒陽性病料的P35保守基因進行測序，通過對P35基因比對分析，了解江西株之間及其與參考毒株間的親緣關(guān)系，為今后進行豬痘病毒的相關(guān)研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2 000、pEASY-T3Cloning Kit均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；JM109工程菌由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。

1.1.2 病料 55份豬皮膚痘痂為2011年-2012年采集自江西省7個地區(qū)（市）共36個規(guī)?；i場中發(fā)生明顯皮膚痘斑的保育豬（30日齡～70日齡）或母豬，用于測序分析的豬痘病毒陽性病料的背景資料見表1。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank登錄的豬痘病毒（AF410153.1）基因序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計一對擴增豬痘病毒P35基因的引物：

擴增目的片段大小為975bp，上、下游引物分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，引物由Invitrogen （上海）有限公司合成。

表1 豬痘病毒陽性皮膚痘痂來源背景Table 1 The background of swinepox virus positive skin variolar crust in Jiangxi province

1.2 方法

1.2.1 病料中豬痘病毒P35基因的PCR檢測 分別取疑似豬痘的皮膚痘痂0.5g剪碎，加入800μL生理鹽水勻漿，12 000r／min離心10min，取上清液600μL，按奧斯伯等［12］介紹的方法，以提取的DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為50μL，其中含10×EasyTaqbuffer 5μL，5U／μL的DNA聚 合 酶 0.5 μL，2.5mmol／L dNTPs 4 μL，20μmol／L的上下游引物各0.5μL，模板2μL，ddH2O 37.5μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃45s，54℃1min，72℃1min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸8mim。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，膠回收擴增產(chǎn)物，送Invitrogen（上海）有限公司測序。

1.2.2 P35基因的克隆及測序 按照天根生化科技（北京）有限公司膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進行回收純化，回收產(chǎn)物與pEASY-T3克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)JM109宿主菌，篩選陽性重組菌。挑取單個菌落送Invitrogen（上海）有限公司進行測序。

1.2.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制 將測序得到的P35基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank登錄的序列進行比較，利用DNA Star軟件中的MegAlign進行P35基因核苷酸序列的同源性和變異分析，并構(gòu)建相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果

2.1 病料的PCR擴增結(jié)果

從55份疑似豬痘的豬皮膚痘痂中提取DNA，經(jīng)PCR擴增，電泳后可見部分病料（44／55）擴增出與預(yù)期大小一致的單一條帶，而正常豬皮膚（無痘斑）則未見擴增條帶（圖1）。結(jié)果表明以上7地區(qū)的部分豬群中存在豬痘病毒的感染。

圖1 病料PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR results of skin vesicles

2.2 P35基因序列分析結(jié)果

對其中19份PCR產(chǎn)物進行測序、分析，結(jié)果表明所測序列與SWPV參考毒株（登錄號：AF410153.1）的P35序列核苷酸同源性為96.3%～98.4%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為87.5%～88.5%；所測序列間的核苷酸同源性為97.7%～100%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為98.2%～100%（圖2）。

2.3 系統(tǒng)進化分析

利用DNA Star軟件構(gòu)建P35基因序列的分子進化樹（圖3）。共分成兩個大的分支，其中SWPVJX03、SWPV-JX04和SWPV-01自成一個分支，與參考毒株（AF10153.1）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；其他與參考毒株組成一個大的分支，其中與參考毒株親緣關(guān)系最近的是SWPV-JX07和SWPV-JX08；各陽性病料之間的同源性都很高。

圖2 P35基因核苷酸序列同源性比較Fig.2 Nucleotide identity of nucleotides from SWPV-JX P35gene

圖3 P35基因核苷酸序列分子進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of nucleotides from SWPV-JX P35gene in Jiangxi province

3 討論

歐洲、北美和大洋洲均有暴發(fā)豬痘的報道，還有先天性感 染 SWPV 的 報 道［2，13-14］。2010年-2011年，巴西圣保羅的3個養(yǎng)豬場共3 460頭豬有850頭出現(xiàn)皮膚膿皰、丘疹癥狀，最后結(jié)痂，利用分子生物學(xué)方法確定該病原為SWPV［4］。國內(nèi)安徽、黑龍江等也有關(guān)于豬痘病例的報道，發(fā)病豬主要集中在保育到育肥階段［9-11］，但僅限于臨床診斷，均未從分子生物學(xué)方面進行研究。

SWPV的全基因組序列測定已完成，其基因組大小約為146kb，含有150個開放閱讀框（ORF）。其中P35基因編碼豬痘病毒胞內(nèi)成熟病毒粒子（IMV）囊膜表面的一個主要結(jié)構(gòu)蛋白P35，其同源基因也存在于其他痘病毒屬，且具有高度保守性［1］，推測其在豬痘病毒中也具有保守性，可用于豬痘病毒的檢測和分析。國外Olivia等利用P35保守基因的同源基因進行痘病毒屬之間的親緣關(guān)系比較分析。

近年來，在江西部分地區(qū)的規(guī)?；i場的保育仔豬常出現(xiàn)疑似SWPV感染的皮膚痘疹樣病變，為了解其病原和感染情況，本文利用PCR方法從收集的55份樣品中檢測到44份陽性病例，陽性率達80%，證實江西省部分地區(qū)豬群中存在豬痘病毒感染。隨機取19份PCR產(chǎn)物進行測序和序列分析，結(jié)果所測的序列與SWPV參考毒株的核苷酸同源性為96.3%～98.4%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為87.5%～88.5%；所測的19條序列之間的核苷酸同源性為97.7%～100%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為98.2%～100%。表明本次擴增的基因均為SWPV的P35基因序列，與參考毒株的相應(yīng)序列相比，變異度不大，保守性較強，可用于SWPV的分子流行病學(xué)調(diào)查和作為SWP診斷的靶標(biāo)。

本試驗從江西部分規(guī)?；i場采集可疑豬痘病毒病料，進行PCR檢測，并對部分PCR產(chǎn)物進行序列測定和分析，并分析比較了地方毒之間、地方毒與國外分離毒之間P35基因變異情況，為江西省豬痘病毒的診斷、預(yù)防及流行病學(xué)研究積累了基礎(chǔ)資料。

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