河南省部分地區(qū)豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒和豬瘟病毒核酸檢測分析

宋宏曉，李蔥曉，王 慧，張明亮，張春杰

（1.洛陽市動物疫病預防控制中心，河南 洛陽 471002；2.河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003）

神經癥狀是獸醫(yī)工作者在臨床診斷中經常遇見的一類動物發(fā)病癥狀，畜禽感染某些疫病時伴有特殊的神經癥狀，這些特殊的神經癥狀能作為示病癥狀，對疫病的診斷有著重要的意義[1－2]。隨著近年來養(yǎng)豬規(guī)模的不斷擴大，引起豬神經癥狀疫病的危害越來越大，有些繁殖母豬所生產的仔豬會表現(xiàn)先天性震顫，嚴重影響仔豬的正常生長。豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）、豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus disease，PCVD）、豬瘟（Classical swine fever，CSF）、豬流行性乙型腦炎、豬鏈球菌病和一些豬中毒病等是目前報道的豬常見的具有神經癥狀的疾病。PR是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起一種伴有嚴重神經癥狀且以母豬的繁殖障礙、仔豬的高死亡率為特征的免疫缺陷性傳染病，也是目前嚴重影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疫病之一[3－4]。PCVD是近20年來發(fā)現(xiàn)的由2型圓環(huán)病毒（PCV－2）引起的一種以仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征為主要特征的免疫缺陷性疫病，主要表現(xiàn)為呼吸困難、消瘦、體表淋巴結腫大和神經癥狀等。CSF是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種熱性高度接觸性且以高死亡率為特征的免疫缺陷性疫病，少數(shù)病豬出現(xiàn)驚厥、痙攣等神經癥狀[5]。這3種病都是目前國內常見的豬傳染病，發(fā)病時都可能會伴有神經癥狀，并表現(xiàn)母豬的繁殖障礙，而且一旦感染后都會損害豬體的免疫器官，造成免疫缺陷，導致其他傳染病的繼發(fā)，并在臨床上常呈混合感染。

近年來，這3種引起豬神經癥狀的免疫缺陷性疫病的單一感染日漸減少，混合感染日趨嚴重[6]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的危害，同時由于類似發(fā)病癥狀給診斷工作帶來了困難，預防和控制該類疫病面臨著更加嚴峻的挑戰(zhàn)。本研究對采集自豫西地區(qū)的具有明顯神經癥狀發(fā)病豬的病料應用RT－PCR和PCR技術進行PRV、PCV－2、CSFV 檢測，以了解豬群中 PR、PCVD和CSF等3種伴有神經癥狀的免疫缺陷性疫病的感染情況，為河南省部分地區(qū)該3種豬病的診斷和防控積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料收集 2010年10月至2012年3月，在河南省平頂山、三門峽、焦作、洛陽等市動物疫病預防控制中心，無菌收集來自各縣市具有明顯神經癥狀發(fā)病豬的樣本共84份，樣品包括扁桃體、淋巴結、脾臟、肺臟等組織，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒購于Bioteke poration公司；AMV反轉錄酶、2×Taq PCR Master Mix、DNA Taq 酶、dNTP Mixture、DL 2000／1000DNA Marker等購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)GenBank公布的基因全序列設計3對分別用以擴增PRV、PCV－2、CSFV的特異性引物，其中PRV選取了gD基因，PCV－2選取了ORF2基因，CSFV選取了E2基因上相對保守的序列，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列見表1。

1.2.2 病料的處理和RNA的提取 取0.5g左右的脾及肺臟置于勻漿器中，剪碎病料，并加入1mL DEPC處理的滅菌雙蒸水，于冰浴中勻漿處理后轉移至1.5mL EP管中，－70℃反復凍融3次，5000r／min離心5min，取上清置－20℃儲存?zhèn)溆?。按RNA提取試劑盒操作說明書提取病料組織中的病毒RNA。

表1 所用引物Table1 Primers used in this study

1.2.3 病料的處理和DNA的提取 按DNA提取試劑盒（離心柱型）操作說明書處理病料（肺臟和脾臟）并提取病毒DNA。

1.2.4 PCV－2與PRV的檢測 以病料中提取的病毒DNA為模版，應用PCR擴增PCV－2與PRV部分基因片段。PRV的PCR反應參數(shù)如下：94℃預變性5min；94℃30s、48℃30s、72℃ 45s，共34個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCV－2的PCR反應參數(shù)如下：94℃預變性5min；94℃30s、65℃30s、72℃30s，共34個循環(huán)；最后72℃延伸10min。10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增產物，前者PRV的目的條帶為220bp，后者PCV－2的目的條帶為650bp。

1.2.5 CSFV的檢測 以病料中提取的病毒RNA為模版，用AMV反轉錄酶和2×Taq Master Mix采用兩步法擴增CSFV目的基因片段。RT反應參數(shù)：42℃50min，99℃5min，5℃5min。PCR反應參數(shù)：94℃預變性5min；94℃30s、57℃30s、72℃40s，共34個循環(huán)；最后72℃延伸10min。10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增產物，目的條帶為280bp。

1.2.6 結果判定 根據(jù)檢測結果，結合病料背景，特別是其臨床癥狀和免疫情況，最終判斷該病料是否發(fā)病。

2 結果

2.1 PRV、PCV－2和CSFV核酸片段檢測結果

應用RT－PCR和PCR的方法，對收集自河南部分地區(qū)的84份有明顯神經癥狀豬的病料樣本進行PRV和PCV－2的PCR及CSFV的RT－PCR檢測。結果PRV陽性63份，陽性率為75.00%，部分陽性樣本結果見圖1；PCV－2陽性51份，陽性率為60.71%，部分陽性樣本見圖2；CSFV陽性27份，陽性率為32.14%，部分陽性樣本見圖3；而無以上任何病原的樣本僅占了總樣本的7.14%。表明該地區(qū)存在PR、PCVD和CSF這3種伴有神經癥狀的豬免疫缺陷性疫病的流行；同時在這3種伴有神經癥狀疫病中以PR發(fā)病為主。結果見表2。

圖1 部分病料PRV基因PCR擴增結果Fig.1 PCR products of part samples for PRV gene

2.2 PRV、PCV－2和CSFV單獨感染統(tǒng)計結果

統(tǒng)計84份樣本中單獨感染的樣本，結果見表3。從表3可以看出，PRV單獨感染21份，感染率25%；PCV－2單獨感染3份，感染率為3.75%；CSFV單獨感染3份，感染率為3.75%。表明在這3種伴有神經癥狀的免疫缺陷性疫病中，單獨感染以PR感染率較高。

2.3 PRV、PCV－2和CSFV混感檢測結果

PRV、PCV－2和CSFV混感檢測情況見表4。從表4可以看出，豫西地區(qū)PRV、PCV－2和CSFV相互之間總混感51份，總混感率為60.71%；二重混感中PRV／PCV－2混感型混感27份，PRV／CSFV混感型混感3份，PCV－2／CSFV 混感型混感9份，PRV／PCV－2／CSFV混感型混感12份，二重混感率分別為32.14%、3.57%、14.29%；三重混感率為14.29%。表明該地區(qū)存在PRV、PCV－2和CSFV 3種豬神經癥狀免疫缺陷性疫病的混合感染，且混感程度較深，總混感率達60.71%；在不同的混感型中，以PRV／PCV－2混感型最嚴重。

圖2 部分病料PCV－2基因PCR擴增結果Fig.2 PCR products of part samples for PCV－2gene

圖3 部分病料CSFV基因R－T PCR擴增結果Fig.3 RT－PCR products of part samples for CSFV gene

表2 PRV、PCV－2和CSFV檢測結果Table2 Detection results of PRV，PCV－2and CSFV

表3 PRV、PCV－2和CSFV單獨感染檢測結果Table3 Detection results of single infection with PRV，PCV－2and CSFV

表4 PRV、PCV－2和CSFV混感檢測結果Table4 Detection results of mixed infections with PRV，PCV－2and CSFV

3 討論

據(jù)報道，PR、PCVD和CSF都可能伴有神經癥狀，尤其以PR最為明顯。目前，對于這3種疫病的研究主要集中在引起母豬繁殖障礙、免疫缺陷機理、疫苗防控、混合感染、診斷方法等[7－9]，而對其伴有的神經癥狀報道內容淺，大多是有關鑒別、診斷和治療。同時，PR、PCVD和CSF現(xiàn)均已成為嚴重影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要的疫病，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。為此，本研究對采集于豫西地區(qū)的伴有明顯神經癥狀豬的病料應用RT－PCR和PCR方法進行PRV、PCV－2、CSFV核酸檢測，以了解豬群中PRV、PCV－2和CSFV 3種伴有神經癥狀的免疫缺陷性疫病的感染情況，為河南省部分地區(qū)神經癥狀疫病的診斷和防控積累資料。

3.1 PRV、PCV－2和CSFV陽性情況

通過對84份伴有神經癥狀的病料樣本進行檢測，結果表明該地區(qū)存在伴有神經癥狀的這3種豬病的流行，且PR和PCV－2陽性率較高，都超過了50%（75.00%和60.71%）；在這3種伴有神經癥狀的疫病中，PR陽性率達75.00%，與陶順梅2011年的研究結果相符[10]。

3.2 PRV、PCV－2和CSFV單獨感染情況

對84份伴有神經癥狀的病料樣本檢測后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)存在這3種疫病的單獨感染，尤以PRV最為嚴重。單獨感染時，PRV的單獨感染率相對較高達25%。與其他省市有差別[11－13]，這可能與河南省的養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度較大有關。前些年，豬偽狂犬病疫情相對穩(wěn)定，呈散發(fā)性流行，另外豬偽狂犬病毒gE基因缺失苗的廣泛應用，有效阻止了該病毒的感染。本研究發(fā)現(xiàn)PCV－2和CSFV的單獨感染率都是3.57%，比較低，這可能與該地區(qū)疫苗的合理應用有關。另外，該地區(qū)的PR單獨感染率較高，除了跟地區(qū)差異因素有關外，與這一地區(qū)養(yǎng)豬戶對于豬偽狂犬病疫苗接種和豬場管理還不夠重視也不無關系。該地區(qū)的PR單獨感染率較高，除了跟地區(qū)差異因素有關外，與這一地區(qū)養(yǎng)豬戶對于豬偽狂犬病疫苗接種和豬場管理還不夠重視也不無關系。

3.3 PRV、PCV－2和CSFV混和感染情況

統(tǒng)計PRV、PCV－2和CSFV的混合感染情況，結果表明該地區(qū)存在PRV、PCV－2和CSFV 3種伴有神經癥狀疫病的混合感染，且混感比例較高，其總混感率達60.71%，混感方式多樣，具有 PRV／PCV－2、PRV／CSFV、PCV－2／CSFV 和 PRV／PCV－2／CSFV 4種混感型；在不同的混感型中，以PRV／PCV－2混感型最嚴重。這為臨床獸醫(yī)工作者診斷提供了方向，當根據(jù)神經癥狀與其他臨床特征可以明顯確診其為PR混感時，首先可以考慮是否為PRV與PCV－2的二重混合感染。在多病原感染中豬偽狂犬病和豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬圓環(huán)病毒病之間二重或多重感染也很常見。楊漢春等[14]對近年來不同地區(qū)規(guī)?；i場死亡豬只57份病料的檢測，結果顯示，二重感染PRV／PCV－2占14.00%，該地區(qū)與之相比混感率較高。

3.4 PRV、PCV－2和CSFV單獨感染與混合感染對比

PRV、PCV－2和CSFV單感與混感情況對比發(fā)現(xiàn)，豫西地區(qū)的總混感率比總單感率高，這與當前的豬病流行特點相符。但是，PRV的單感率比PRV／CSFV、PCV－2／CSFV和PRV／PCV－2／CSFV 3種混感型的混感率都要高，認為這與PRV這種病本身不無關系。本研究采集的病料樣本是伴有神經癥狀豬的，而PR是由豬偽狂犬病毒引起的一種初生仔豬伴有神經癥狀，病程短，病死率極高的傳染病[15]。因為伴有神經癥狀的PR病發(fā)于仔豬的出生階段，而且病程短，所收集病料的豬缺少繼發(fā)PCVD和CSF這時間過程，所以PRV的單感率比3種混感型混感率都高與該病本身有關。然而出生3d的仔豬卻易發(fā)PCVD，同時在該階段存在母豬的疫苗接種不到位而導致小豬體內抗體滴度低這種可能，所以易造成PR與PCV－2混合感染。

PR、PCVD和CSF 3種伴有神經癥狀的免疫缺陷性疫病，對目前的養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的危害。既可以造成繁殖障礙，又可以引起免疫缺陷，導致疫病的混合感染。本研究通過對84份采集豫西地區(qū)伴有神經癥狀的病料樣本檢測，統(tǒng)計它們的陽性情況、單感情況、混感情況以及單感與混感的對比情況，分析發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)存在這3種伴有神經癥狀疫病的流行，包括單感流行和混感流行；單感中以PRV為主要流行，混感中以PRV／PCV－2這種混感型為主要流行；混感復雜，具有 PRV／PCV－2、PRV／CSFV、PCV－2／CSFV和PRV／PCV－2／CSFV 4種混感型；混感總混感率比單感總單感率高，而PRV的單感率比PRV／CSFV、PCV－2／CSFV和PRV／PCV－2／CSFV 3種混感型的混感率卻都要高。

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