副豬嗜血桿菌毒力因子研究進(jìn)展

馬廣鵬

（中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京100045）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，是一種具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的不能運(yùn)動多形性小桿菌，能引起豬的多發(fā)性纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎［1］。近年來，H.parasuis的感染引起了豬的高發(fā)病率和高死亡率，已給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。另一方面，H.parasuis是豬上呼吸道的常在菌，能從假定健康豬的鼻腔和上呼吸道中分離［1］。由于菌株毒力的差異，急性和慢性病例臨床特征也存在很大的差異［2］。對H.parasuis毒力因子的鑒定是深入研究其致病機(jī)制和對制定更有效的H.parasuis感染的防控策略具有重要意義。

H.parasuis血清型通常被認(rèn)為是毒力的一個指征。用血清分型方法可將H.parasuis分為15個血清型［2］，但有很大比例的臨床分離菌株不能確定其血清分型。通過腹腔注射感染SPF豬，將15個血清型的毒力劃分為能高發(fā)病率和高病死率的強(qiáng)毒力血清型菌株，能引起多發(fā)性漿膜炎而死亡的中等毒力菌株和不引起任何臨床癥狀的無毒力菌株。但也有研究發(fā)現(xiàn)，同一血清型的菌株毒力存在很大的差異，因此，血清型和毒力之間似乎沒有確切的相關(guān)性。

通過基因遺傳操作構(gòu)建突變株是從分子水平上闡明基因功能的重要手段之一。細(xì)菌通常遺傳操作方法有結(jié)合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)和自然轉(zhuǎn)化。自然轉(zhuǎn)化是細(xì)菌通過同源重組的方法有效將大分子DNA攝取和重組到宿主基因組上的過程。Bigas A等［3］建立了一種具有環(huán)腺苷酸（cAMP）依賴性自然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。Zhang B等［4］在此基礎(chǔ)上對該系統(tǒng)進(jìn)行改造，建立了以SC096為模式菌株的一種不需要依賴cAMP新的自然轉(zhuǎn)化方法。利用該系統(tǒng)構(gòu)建了一系列基因缺失株，對基因功能和毒力因子的進(jìn)行了深入的研究。另外，有些研究者則通過在體外模擬細(xì)菌感染的環(huán)境來發(fā)現(xiàn)H.parasuis的毒力因子［5-9］。也有研究者通過與巴斯德菌科其他細(xì)菌的已知毒力因子序列比對，在基因組水平上鑒定H.parasuis潛在的毒力因子［10-13］。隨著H.parasuis全基因組序列的釋放，并結(jié)合遺傳操作系統(tǒng)的建立和傳統(tǒng)功能基因分析方法的運(yùn)用極大的促進(jìn)了毒力因子和致病機(jī)制的研究。本文對H.parasuis毒力因子的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 副豬嗜血桿菌毒力因子

副豬嗜血桿菌毒力因子包括外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）。在革蘭陰性菌中，外膜是保證細(xì)菌能夠在不同生存環(huán)境中定殖和生存的重要結(jié)構(gòu)。鑒于獨(dú)特的成分和物理特性，外膜作為一個選擇的“分子篩”能夠阻擋很多的有毒分子進(jìn)入細(xì)胞，對于細(xì)菌的生存是至關(guān)重要的。同時，外膜是不對稱的磷脂雙分子層，LPS和β-筒狀Omp鑲嵌在外膜上。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌LPS和Omp不但具有維持外膜結(jié)構(gòu)和保證物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ?，還參與細(xì)菌的致病特別是宿主細(xì)胞的黏附入侵，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和抵抗血清中補(bǔ)體系統(tǒng)殺菌作用等一系列的功能［14］。H.parasuis的LPS和Omp和毒力有一定的聯(lián)系。Ruiz A等［15］比較了從發(fā)病豬的實(shí)質(zhì)器官和健康動物的上呼吸道分離的不同H.parasuis Omp型，發(fā)現(xiàn)36.3ku～38.5ku的Omp可能與毒力相關(guān)。在全基因序列中，只有OmpP2和OmpP5的分子質(zhì)量恰好符合與毒力因子范圍，也被鑒定為潛在的毒力因子。H.parasuis LPS和其他的細(xì)菌一樣作為內(nèi)毒素在致病過程中發(fā)揮著重要的作用，同時也部分介導(dǎo)對宿主細(xì)胞的黏附作用和炎性因子的釋放。

1.1 外膜蛋白P2

外膜蛋白P2基因（OmpP2）屬于微孔蛋白，基本功能是形成親水通道以利于環(huán)境中小分子物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)。目前流感嗜血桿菌OmpP2蛋白的生理功能和致病機(jī)理的研究較為透徹OmpP2是流感嗜血桿菌的一個毒力因子，是逃避宿主補(bǔ)體殺傷和參與宿主細(xì)胞的黏附作用的一個重要免疫原性蛋白［16］。在b型的流感嗜血桿菌中，缺失了OmpP2基因后導(dǎo)致菌株對小鼠致病力的下降［17］。最新研究表明流感嗜血桿菌OmpP2膜外結(jié)構(gòu)域能激活宿主細(xì)胞的信號通路分子并誘導(dǎo)促炎癥因子的表達(dá)，表明了OmpP2蛋白在病原菌致病性中起著重要作用［18］。

H.parasuis OmpP2是外膜中最豐富的蛋白，也是最受關(guān)注度的外膜蛋白。OmpP2蛋白表現(xiàn)出了很大程度的序列異質(zhì)性，這種序列異質(zhì)性可能與宿主的免疫壓力相關(guān)，也可能與菌株的毒力有一定的聯(lián)系。趙倩等［19］研究發(fā)現(xiàn)，H.parasuis中存在兩個不同的蛋白結(jié)構(gòu)，在大多數(shù)的毒力參考菌株和系統(tǒng)分離菌株中存在兩個不連續(xù)的基因序列缺失，即參考菌株血清型為2、4、5、10、12、13、14和15的菌株中OmpP2基因存在兩處連續(xù)堿基缺失，而參考菌株血清型為1、3、6、7、8、9和11的菌株中 OmpP2基因沒有這種缺失情況，暗示了這種缺失現(xiàn)象主要在強(qiáng)毒力血清型的菌株中，分別將參考菌株血清5和11型的OmpP2基因構(gòu)建在真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清5型OmpP2基因有明顯的細(xì)胞毒性作用，且隨著轉(zhuǎn)染中質(zhì)粒劑量的增加，對細(xì)胞的毒性作用也隨之增加，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系；而血清11型的OmpP2基因在相同劑量和轉(zhuǎn)染條件下對Marc-145細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性作用。以上結(jié)果說明了H.parasuis OmpP2基因結(jié)構(gòu)特征與毒力的關(guān)系，堿基連續(xù)缺失的OmpP2基因是H.parasuis的一個毒力相關(guān)基因。但是ompP2基因具體的功能還是不清楚的。

Zhang B等［4］通過自然轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建了H.parasuis血清4型的臨床分離株SC096的ompP2的基因缺失菌株（ΔompP2）。和野生菌株SC096相比，ΔompP2缺失株表現(xiàn)出了顯著地生長能力的下降，表現(xiàn)出了對豬和兔血清中補(bǔ)體殺菌敏感性的顯著升高。OmpP2蛋白的缺失還表現(xiàn)出了對豬肺泡巨噬細(xì)胞的黏附能力和細(xì)胞外的生存能力下降。同時，從SC096菌株提取純化的OmpP2蛋白也介導(dǎo)了對肺泡巨噬細(xì)胞的黏附作用［20］。以上結(jié)果表明OmpP2在維持細(xì)菌生長、抗血清中補(bǔ)體殺菌作用和對宿主細(xì)胞的黏附作用中發(fā)揮著重要的作用。抵抗血清中補(bǔ)體作用和黏附宿主細(xì)胞被認(rèn)為是H.parasuis致病機(jī)制。因此，以上結(jié)果說明ompP22基因是H.parasuis的一個毒力因子。

1.2 外膜蛋白P5

H.parasuis OmpP5蛋白由ompP5基因編碼，是OmpA蛋白家族的一員。外膜蛋白A家族是革蘭陰性菌外膜中的主要成分并具有保守性，其主要作用是維持外膜的完整，此外在細(xì)菌的致病侵襲過程中發(fā)揮著重要作用［21］。在致病性大腸埃希菌中，OmpA具有抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的血清的殺傷的作用抗大腸埃希菌OmpA抗體與補(bǔ)體形成抗原抗體復(fù)合物，通過經(jīng)典途徑溶解殺傷細(xì)菌［22］。OmpA通常認(rèn)為是細(xì)菌的黏附素并參與了入侵作用。在流感嗜血桿菌中，OmpP5蛋白是菌株定殖在栗鼠鼻咽和感染中耳的必需因子［23］。通過阻斷與受體的相互作用能減少流感嗜血桿菌在上呼吸道的定殖能力和降低感染過程導(dǎo)致的嚴(yán)重疾病。在多殺性巴氏桿菌和豬放線桿菌中也證實(shí)了OmpP5參與了細(xì)菌的黏附作用［24］。另外，在大腸埃希菌中證實(shí)了OmpA是入侵腦靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要的因子，缺失了OmpA基因的細(xì)菌比野生型在入侵細(xì)胞上下降了25倍～50倍［25］。

H.parasuis OmpP5也表現(xiàn)了相當(dāng)大的異質(zhì)性，包括四個高變區(qū)，主要編碼四個預(yù)測的細(xì)胞表面暴露環(huán)。在H.parasuis SC096菌株中，當(dāng)缺失了ompP5基因，細(xì)菌的生長能力受到了明顯的影響。但野生菌株和缺失株的其他方面的表型，包括對豬和兔血清的殺菌作用、對PK-15細(xì)胞和PUVEC的黏附入侵能力都沒有明顯的變化［26］。

1.3 H.parasuis LPS的庚糖基轉(zhuǎn)移酶

LPS包括了3個部分，即類脂A、核心多糖和O側(cè)鏈。脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS）是缺少 O側(cè)鏈。然而，H.parasuis可能表達(dá)LPS，也可能表達(dá)LOS。革蘭陰性菌LPS在致病性中發(fā)揮著重要的作用，例如在黏附、入侵、血清敏感性、抗生素抗性和內(nèi)毒素等作用在致病機(jī)理方面。H.parasuis LPS和其他的細(xì)菌一樣在致病中產(chǎn)生內(nèi)毒素性休克、加劇臨床癥狀和加速死亡等癥狀中揮著重要的作用。Bouchet B等［27］發(fā)現(xiàn)H.parasuis的LOS能夠部分介導(dǎo)對新生豬氣管上皮細(xì)胞（NPTr）的黏附作用，另外，LOS能夠激發(fā)NPTr的IL-6和IL-8釋放和誘導(dǎo)半胱天冬酶-3-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

根據(jù)序列比對和功能預(yù)測，Xu Z等［12］闡明了在SH0165菌株LPS生物合成通路中的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)合成類脂A和內(nèi)部核心寡糖的相關(guān)合成基因在嗜血桿菌屬中是高度保守的，反映了核心結(jié)構(gòu)在維持外膜完整性中發(fā)揮著重要的作用。內(nèi)部核心結(jié)構(gòu)通常包括3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸（Kdo）和L-乙酰-D-甘露庚糖（L，D-Hep）。在結(jié)構(gòu)上，內(nèi)部寡糖鏈和脂寡糖鏈通過糖基轉(zhuǎn)移酶連續(xù)的將糖基轉(zhuǎn)移到類脂A（Lipid A）上面。類脂A部分的骨架的6’位是2→4位連接的二糖3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸（Kdo），第一個庚糖通過庚糖基轉(zhuǎn)移酶（heptosyltransferase）將其轉(zhuǎn)移到第一個Kdo基團(tuán)的5位上。缺失Kdo或Lipid A的缺失株是致死的，但是庚糖的缺失是能實(shí)現(xiàn)的，并能夠使LPS的結(jié)構(gòu)有明顯的縮短，因此庚糖基因的缺失株是研究LPS功能的理想靶基因。通過對副豬嗜血桿菌SH0165的基因組信息進(jìn)行查找，鑒定了opsX，rfaF和waaQ3個基因，這3個基因能夠編碼庚糖基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)將3個庚糖（庚糖Ⅰ、庚糖Ⅱ和庚糖Ⅲ）轉(zhuǎn)移到脂寡糖上。

在致病性的革蘭陰性菌中，對opsX和rfaF基因的敲除使得細(xì)菌不能將第1個和第2個庚糖轉(zhuǎn)移到Kdo上，導(dǎo)致了缺失株的糖鏈變短，同時也降低了對宿主的致病性。通過比對H.parasuis SH0165株的基因組序列，鑒定了編碼能夠?qū)⒏寝D(zhuǎn)移到LPS上的heptosyltransferase（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）基因opsX、rfaF和 waaQ。Xu C等［28］利用自然轉(zhuǎn)化的方法在SC096株中構(gòu)建了 ΔopsX、ΔrfaF和ΔwaaQ缺失菌株以及相應(yīng)的互補(bǔ)株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有opsX基因缺失株的生長速度稍有下降，互補(bǔ)菌株恢復(fù)到野生型水平。其他兩個菌株的生長速度無明顯的變化。在脂寡糖糖型的變化中，ΔopsX和ΔrfaF缺失株都有明顯縮短的LPS結(jié)構(gòu)，推測庚糖Ⅰ和庚糖Ⅱ缺失株的脂寡糖的缺失結(jié)構(gòu)可能是Kdo-Lipid A和Hep-Kdo-Lipid A，而ΔwaaQ缺失株沒有明顯的變化，庚糖Ⅲ位于LPS的側(cè)鏈上。ΔopsX、ΔrfaF和ΔwaaQ缺失株都降低了對豬和兔血清中補(bǔ)體的殺菌作用，說明了H.parasuis庚糖Ⅰ、庚糖Ⅱ和庚糖Ⅲ在抵抗宿主的先天性防御中發(fā)揮著重要的作用。在宿主細(xì)胞的相互作用中，ΔopsX、ΔrfaF缺失菌株對PK-15和PUVEC細(xì)胞的黏附和入侵能力有顯著地下降，而ΔwaaQ缺失菌株沒有明顯的變化，該結(jié)果說明了H.parasuis可能與LPS的結(jié)構(gòu)相關(guān)，LPS結(jié)構(gòu)縮短的菌株的黏附入侵能力有顯著地下降，說明了LPS糖鏈的長度可能影響了副豬嗜血桿菌的黏附入侵能力。因此，LPS中編碼庚糖Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的opsX、rfaF和waaQ基因是H.parasuis的毒力因子。

2 H.parasuis潛在的毒力因子

2.1 在體外模擬體內(nèi)感染條件下鑒定潛在的毒力因子

感染H.parasuis后豬通常出現(xiàn)體溫升高的癥狀，這是致病性的重要特征之一。為了模擬體內(nèi)環(huán)境，將H.parasuis培養(yǎng)在熱壓力的環(huán)境下，通過差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DDRT-PCR）和基因芯片的方法尋找差異表達(dá)的基因［5-7］。Hill C E等［5］利用DDRT-PCR的方法在熱誘導(dǎo)下鑒定了7個差異表達(dá)的基因，分別編碼轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、脂肪酸和氨基酸合成等相關(guān)蛋白。該研究是首次利用H.parasuis在體外模擬宿主環(huán)境鑒定潛在毒力因子。Melnikow D S等［7］也利用在體外模擬體內(nèi)的H.parasuis感染環(huán)境，包括缺鐵、酸和溫度壓力及在微需氧環(huán)境等條件下，利用基因芯片技術(shù)來鑒定差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示共鑒定了75個差異表達(dá)的基因，主要是編碼鐵和糖代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、代謝酶、核酸代謝和假定蛋白等。其中一些基因與巴斯德菌屬其他菌株的已知毒力因子的核酸序列具有高度同源性。這兩個研究雖然都對H.parasuis潛在毒力因子進(jìn)行了分析，但并未進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證，其作為毒力因子的生物學(xué)意義尚不清楚。

鐵是幾乎所有細(xì)菌必需的營養(yǎng)元素，捕獲和攝取鐵對于感染過程中細(xì)菌的生存和增殖都是必需的。由于在宿主體內(nèi)鐵的含量低，致病菌螯合鐵的能力被認(rèn)為是致病力密切相關(guān)。為了研究H.parasuis對缺鐵環(huán)境的反應(yīng)，研究者采用基因芯片技術(shù)［7］、DDRT-PCR［8］和 轉(zhuǎn) 錄 序 列 選 擇 性 捕 獲（SCOTS）［9］等多種技術(shù)來研究其與細(xì)菌毒力的關(guān)系。在鐵限制的條件下，Metcalf D S等［8］通過DDRT-PCR發(fā)現(xiàn)了10個差異表達(dá)的基因，在豬腦脊液存在的情況下發(fā)現(xiàn)了9個差異表達(dá)的基因。在鐵限制或在腦脊液存在的情況下有5個基因片段同時上調(diào)的現(xiàn)象，分別是腺苷酸基琥珀酸合成酶（purA）、2’，3’-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（cpdB）、脂蛋白信號肽（spA）、焦磷酸還原酶（lytB）和過氧化物歧化酶（sodC）。為了進(jìn)一步研究差異基因和毒力的關(guān)系，在15個血清型的參考菌株中對上調(diào)基因片段的進(jìn)行了篩選。值得注意的是，cpdB在15個血清型中存在兩種不同的基因長度。分離自患病豬的參考菌株的片段為394bp，而從健康豬群的菌株的片段為1 463bp，這個結(jié)果暗示了394-bp的片段可能和大多數(shù)參考菌株的毒力有一定關(guān)系。但是394bp的cpdB基因片段和臨床分離株在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著相關(guān)性。因此，在H.parasuis中不同的長度的cpdB功能還需要進(jìn)一步的研究。Xie Q等［9］利用SCOTS方法研究鐵限制壓力下H.parasuis的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。有36個基因上調(diào)，分為為6個不同功能群：細(xì)菌表面蛋白、核酸代謝、能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白。有趣的是在上調(diào)基因中，Clp蛋白酶編碼蛋白屬于Clp／HSP100分子伴侶家族，能夠從聚合狀態(tài)中拯救出變性的蛋白，在高溫、酸性、氧化和鐵限制生長的情況下用DNA芯片技術(shù)也鑒定出該應(yīng)激蛋白編碼基因。因此，Clp蛋白酶與毒力的聯(lián)系值得進(jìn)一步研究。另外，ArcB感應(yīng)激酶的表達(dá)量上調(diào)也已經(jīng)被鑒定在限鐵的條件下。ArcB屬于雙組份轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（2-CS）的組氨酸激酶。2-CS在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化和致病過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，包括環(huán)境變化時發(fā)揮作用的組氨酸激酶（HK）和一種能夠被相應(yīng)HK激活的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報(bào)道的H.parasuis SH0165的基因組，可找到3對雙組份系統(tǒng)分別是CpxAR、QseCB和ArcBA。另外，在巴斯德菌科的細(xì)菌中CpxAR、QseCB和ArcBA已被鑒定為毒力因子。因此，ArcB在致病過程中的作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2 在基因組的水平上鑒定潛在的毒力因子

抑制性消減雜交技術(shù)也被用于鑒定Nagasaki和SW114（血清3型無毒力菌株）、SH0165（血清5型毒力菌株）和7140（血清4型無毒力菌株）的遺傳差異［11，13］。通過該方法鑒定出15個差異表達(dá)基因片段存在于Nagasaki菌株中，而不存在于SW114菌株中，它們編碼的蛋白分別屬于細(xì)菌表面蛋白、核酸代謝、應(yīng)激反應(yīng)、噬菌體、菌毛相關(guān)蛋白和一些未知蛋白，對參考菌株的PCR檢測顯示，大部分的基因只存在于毒力和中等毒力血清型菌株，不存在于低毒力或無毒力血清型菌株［13］。Wang X 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，有33個基因片段只存在于SH0165而不存在于7140菌株，分別sclB家族、限制性修飾系統(tǒng)、噬菌體產(chǎn)物、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、外膜蛋白和核酸代謝。通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，sclB7、sclB11、ABC-型轉(zhuǎn)運(yùn)子、nhaC和fhuA基因在毒力菌株中比無毒力菌株中更普遍存在。屬于sclB家族的sclB7和sclB11基因和毒力相關(guān)基因與三聚體自動轉(zhuǎn)運(yùn)子（VtaA）有很高的同源性。副豬嗜血桿菌含有17個拷貝的三聚體自動轉(zhuǎn)運(yùn)子（vtaA），它的結(jié)構(gòu)域含有類似黏附素，血凝素和入侵素的基序和重復(fù)特征，在毒力菌株和非毒力菌株中有很大的差異。該試驗(yàn)進(jìn)一步說明了VtaA在H.parasuis致病中發(fā)揮著重要的作用。

為了進(jìn)一步鑒定毒力因子，Xu Z等［12］比較了H.parasuis SH0165株和其他巴氏桿菌科的細(xì)菌基因組，包括杜克雷嗜血桿菌35000HP、流感嗜血桿菌Rd、睡眠嗜血桿菌129PT、胸膜肺炎放線桿菌JL03、琥珀酸放線桿菌130Z、伴放線嗜血桿菌NJ8700、伴放線放線桿菌D11S-1、巴氏桿菌Pm70和曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌MBEL55E，結(jié)果顯示H.parasuis許多毒力因子在基因組水平上被鑒定，例如多糖、菌毛和鐵攝取系統(tǒng)。特別是發(fā)現(xiàn)了編碼糖基轉(zhuǎn)移酶／脂多糖的生物合成蛋白wbgY和與細(xì)菌莢膜多糖生物合成相關(guān)的蛋白的潛在毒力基因capD已經(jīng)在Nagasaki基因組中被鑒定出來，而在SW114弱毒參考菌株中卻沒發(fā)現(xiàn)2個基因［13］。在革蘭陰性菌中，莢膜位于外膜的外部，由高度親水的陰離子多糖組成，能夠通過抗吞噬，保護(hù)細(xì)菌免受補(bǔ)體的殺傷作用和介導(dǎo)對細(xì)胞表面的黏附作用等致病過程中發(fā)揮著重要的作用。在H.parasuis中，莢膜可能和抗吞噬相關(guān)，但H.parasuis莢膜致病相關(guān)的分子機(jī)制在很大程度上還是未知的。

3 總結(jié)

在養(yǎng)豬業(yè)中，H.parasuis被認(rèn)為是能明顯產(chǎn)生危害的細(xì)菌性病原因素之一，同時也被認(rèn)為是豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合因素中重要的病原誘因。但是H.parasuis在臨床上表型差異菌株廣泛存在，尤其是對不同毒力表型菌株差異的本質(zhì)認(rèn)識不足，關(guān)于毒力相關(guān)因子和細(xì)菌感染宿主過程中如何發(fā)揮致病作用以及病原宿主相互作用的分子基礎(chǔ)等知之甚少。近年來一些新技術(shù)和新方法的利用開始逐漸的揭示H.parasuis的毒力因子，為致病機(jī)制的研究提供了一定的基礎(chǔ)。重要的是遺傳操作方法的建立和基因缺失株的構(gòu)建，對潛在毒力因子的功能鑒定和致病機(jī)制的研究提供了技術(shù)平臺。

［1］ Oliveira S，Pijoan C.Haemophilus parasuis：new trends on diagnosis，epidemiology and control［J］.Vet Microbiol，2004，99：1-12.

［2］ Kielstein P，Rapp-Gabrielson V J.Designation of 15serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts［J］.J Clin Microbiol，1992，30：862-865.

［3］ Bigas A，Garrido M E，de Rozas A M，et al.Development of a genetic manipulation system for Haemophilus parasuis ［J］.Vet Microbiol，2005，25，105（3-4）：223-228.

［4］ Zhang B，F(xiàn)eng S，Xu C，et al.Serum resistance in Haemophilus parasuis SC096strain requires outer membrane protein P2 expression［J］.FEMS Microbiol Lett，2012，326：109-115.

［5］ Hill C E，Metcalf D S，MacInnes J I.A search for virulence genes of Haemophilus parasuis using differential display RTPCR ［J］.Vet Microbiol，2003，96：189-202.

［6］ Jin H，Wan Y，Zhou R，et al.Identification of genes transcribed by Haemophilus parasuis in necrotic porcine lung through the selective capture of transcribed sequences（SCOTS）［J］.Environ Microbiol，2008，10：3326-3336.

［7］ Melnikow E，Dornan S，Sargent C，et al.Microarray analysis of Haemophilus parasuis gene expression under in vitro growth conditions mimicking the in vivo environment［J］.Vet Microbiol，2005，110：255-263.

［8］ Metcalf D S，MacInnes J I.Differential expression of Haemophilus parasuis genes in response to iron restriction and cerebrospinal fluid［J］.Can J Vet Res，2007，71：181-188.

［9］ Xie Q，Jin H，Luo R，et al.Transcriptional responses of Haemophilus parasuis to iron-restriction stress in vitro［J］.Biometals，2009，22：907-916.

［10］ Sack M，Baltes N.Identification of novel potential virulenceassociated factors in Haemophilus parasuis［J］.Vet Microbiol，2009，136：382-386.

［11］ Wang X，Xu X，Zhang S，et al.Identification and analysis of potential virulence-associated genes in Haemophilus parasuis based on genomic subtraction［J］.Microb Pathog，2011，51：291-296.

［12］ Xu Z，Yue M，Zhou R，et al.Genomic characterization of Haemophilus parasuis SH0165，a highly virulent strain of serovar 5prevalent in China［J］.PLoS One，2011，6：e19631.

［13］ Zhou H，Yang B，Xu F，et al.Identification of putative virulence-associated genes of Haemophilus parasuis through suppression subtractive hybridization［J］.Vet Microbiol，2010，144：377-383.

［14］ Achouak W，Heulin T，Pages J M.Multiple facets of bacterial porins［J］.FEMS Microbiol Lett，2001，199（1）：1-7.

［15］ Ruiz A，Oliveira S，Torremorell M，Pijoan C.Outer membrane proteins and DNA profiles in strains of Haemophilus parasuis recovered from systemic and respiratory sites［J］.J Clin Microbiol，2001，39（5）：1757-62.

［16］ Ram S，Cullinane M，Blom A M，et al.Binding of C4b-binding protein to porin：a molecular mechanism of serum resistance of Neisseria gonorrhoeae ［J］.J Exp Med，2001，193（3）：281-295.

［17］ Cope L D，Pelzel S E，Latimer J L，et al.Characterization of a mutant of Haemophilus influenzae type b lacking the P2 major outer membrane protein［J］.Infect Immun，1990，58（10）：3312-3318.

［18］ Galdiero S，Vitiello M，Amodeo P，et al.Structural requirements for proinflammatory activity of porin P2Loop 7from Haemophilus influenzae ［J］.Biochemistry，2006，45（14）：4491-4501.

［19］ 趙 倩，湯 承，楊發(fā)龍，等.副豬嗜血桿菌ompP2基因的結(jié)構(gòu)特征及其與毒力的聯(lián)系 ［J］.中國科學(xué)：生命科學(xué)，2010，40（6）：522-532.

［20］ Zhang B，Xu C，Liao M.Outer membrane protein P2of the Haemophilus parasuis SC096strain contributes to adherence to porcine alveolar macrophages cells ［J］.Vet Microbiol，2012，158：226-227

［21］ Smith S G，Mahon V，Lambert M A，et al.A molecular Swiss army knife：OmpA structure，function and expression［J］.FEMS Microbiol Lett，2007，273：1-11.

［22］ Weiser J N，Gotschlich E C.Outer membrane protein A（OmpA）contributes to serum resistance and pathogenicity of Escherichia coli K-1［J］.Infect Immun，1991，59（7）：2252-2258.

［23］ Reddy M S，Bernstein J M，Murphy T F，et al.Binding between outer membrane proteins of nontypeable Haemophilus influenzae and human nasopharyngeal mucin［J］.Infect Immun，1996，64（4）：1477-1479.

［24］ Dabo S M，Confer A W，Quijano-Blas R A.Molecular and immunological characterization of Pasteurella multocida serotype A：3OmpA：evidence of its role in P.multocidainteraction with extracellular matrix molecules［J］.Microb Pathog，2003，35（4）：147-157.

［25］ Prasadarao N V，Wass C A，Weiser J N，et al.Outer membrane protein A of Escherichia coli contributes to invasion of brain microvascular endothelial cells ［J］.Infect Immun，1996，64（1）：146-153.

［26］ Zhang B，Xu C，Zhou S，et al.Comparative proteomic analysis of a Haemophilus parasuis SC096mutant deficient in the outer membrane protein P5 ［J］.Microb Pathog 2012，52：117-124.

［27］ Bouchet B，Vanier G，Jacques M，et al.Studies on the interactions of Haemophilus parasuis with porcine epithelial tracheal cells：limited role of LOS in apoptosis and pro-inflammatory cytokine release［J］.Microb Pathog，2009，46：108-113.

［28］ Xu C，Zhang L，Zhang B，et al.Involvement of lipooligosaccharide heptose residues of Haemophilus parasuis SC096 strain in serum resistance，adhesion and invasion［J］.Vet J，2012，doi.org／10.1016／j.tvjl.2012.06.017.