酵母細(xì)胞提取物依賴NO信號(hào)途徑提高杭白菊抗氧化活性

陳 倩，陳尊委，徐竑珂，楊鳳霞，符孟娜，李盛超，王慧中，徐茂軍

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036）

0 引 言

藥用植物的療效高低是決定中藥材品質(zhì)優(yōu)劣的基礎(chǔ)．傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)在長(zhǎng)期臨床和生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，在藥用植物生長(zhǎng)過程中光照、溫度等外界環(huán)境因子對(duì)療效品質(zhì)的影響是一種十分普遍的現(xiàn)象［1－2］．這表明在藥用植物體內(nèi)存在著可被外界環(huán)境因子激活的療效品質(zhì)形成自然調(diào)控機(jī)制．顯然，理解這一機(jī)制的作用原理，將為研究開發(fā)藥用植物療效品質(zhì)調(diào)控新技術(shù)提供重要的理論依據(jù)．

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藥用植物中黃酮、生物堿等次生代謝產(chǎn)物是決定中藥材療效品質(zhì)的主要物質(zhì)［3－4］．藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成是由細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因控制的復(fù)雜生物化學(xué)反應(yīng)過程．雖然環(huán)境因子可以影響次生產(chǎn)物的含量，但是作為外界刺激因子其本身并不直接參與次生產(chǎn)物的合成反應(yīng)，因此在藥用植物細(xì)胞中必然存在著相應(yīng)的機(jī)制介導(dǎo)外界環(huán)境因子對(duì)胞內(nèi)相關(guān)次生代謝反應(yīng)的促進(jìn)作用．根據(jù)現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論，不難推測(cè)在藥用植物細(xì)胞中應(yīng)該存在著特定的次生代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，外界環(huán)境因子通過激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)次生代謝信號(hào)途徑，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞核內(nèi)次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)次生產(chǎn)物的合成積累，最終影響中藥材的療效品質(zhì)［5－6］．

一氧化氮（NO）是植物中一種重要信號(hào)分子［7］．近年來，國(guó)內(nèi)外不少研究者對(duì)NO在介導(dǎo)光照、溫度、誘導(dǎo)子等外界因子促進(jìn)長(zhǎng)春花、金絲桃等藥用植物細(xì)胞次生活性物質(zhì)合成積累中的信號(hào)調(diào)控作用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)：1）光照（UVB）、溫度（高溫?zé)峒ぃ?、誘導(dǎo)子等外界處理不僅可以促進(jìn)金絲桃等藥用植物細(xì)胞藥效物質(zhì)的合成積累，還可以顯著提高細(xì)胞內(nèi)源NO水平［8－10］，說明外界因子在誘發(fā)藥效物質(zhì)合成的同時(shí)也激活了胞內(nèi)NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；2）NO信號(hào)抑制劑可以阻斷細(xì)胞中NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，同時(shí)還可以抑制外界因子對(duì)細(xì)胞中藥效物質(zhì)合成的促進(jìn)作用，而且NO抑制劑對(duì)外界因子誘發(fā)藥效合成的抑制作用可以被外源NO逆轉(zhuǎn)［8－10］．上述研究結(jié)果不僅證實(shí)了光照、溫度等環(huán)境因子通過激活胞內(nèi)NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)藥效物質(zhì)合成積累的作用機(jī)制，同時(shí)提示內(nèi)源NO是藥用植物藥效品質(zhì)形成的一個(gè)新的調(diào)控位點(diǎn)：即通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)源NO水平，可以激活藥用植物相關(guān)調(diào)控機(jī)制，改善中藥材療效品質(zhì)，這無疑為藥用植物品質(zhì)調(diào)控提供了一種新的思路．

NO合成與積累是植物在逆境脅迫下的一種普遍現(xiàn)象［11］．雖然前期研究表明，紫外光照射、高溫、干旱等逆境處理均可以顯著提高擬南芥等植物細(xì)胞內(nèi)源NO水平［7，9－11］，但是由于逆境脅迫往往對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中難以利用逆境脅迫激活藥用植物內(nèi)源NO信號(hào)途徑，促進(jìn)次生產(chǎn)物合成積累．最近，筆者發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞壁多糖提取物可以誘導(dǎo)桃果實(shí)中NO迸發(fā)［12］，因此提出了以下研究設(shè)想：以酵母提取物處理藥用植物，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)源NO迸發(fā)，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)調(diào)控機(jī)制，提高藥用植物的療效品質(zhì)．

杭白菊是浙江省著名的道地藥材．據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年僅桐鄉(xiāng)市的杭白菊產(chǎn)量就占全國(guó)產(chǎn)量的80%．現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，杭白菊具有抗氧化以及解熱、明目、抑菌等功效，其中抗氧化作用是杭白菊的主要功效之一［13］．本文擬以杭白菊為材料，考查酵母提取物（YE）對(duì)杭白菊抗氧化活性的影響，并探討NO在介導(dǎo)酵母提取物提高杭白菊藥效功能中的作用，驗(yàn)證上述研究設(shè)想．

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

供試材料為目前杭白菊主栽品種小洋菊．

酵母粗提物購(gòu)自湖州禮來生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)：LM801H），按前文［12］方法制備實(shí)驗(yàn)用酵母提取物．

1．2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)在浙江省桐鄉(xiāng)市屠甸鎮(zhèn)進(jìn)行，試驗(yàn)土壤的理化性質(zhì)如下：pH6．7，有機(jī)質(zhì)21．1g／kg，全氮0．881 g／kg，有效磷16．2mg／kg，速效鉀104．5mg／kg．

1．3 杭白菊栽培管理

試驗(yàn)采用大田栽培，畦寬1．5m，每穴2株，5 000株／畝，穴距15cm．4月15日定植，5月16日第一次壓條，7月15日第二次壓條，6月10日和7月11日兩次打頂．按照杭白菊栽培管理要求進(jìn)行常規(guī)的施肥、除草和病蟲害防治．

1．4 試驗(yàn)處理

1．4．1 YE不同施用時(shí)期對(duì)杭白菊抗氧化活性的影響

試驗(yàn)設(shè)為4個(gè)不同的時(shí)期：苗期（5月5日）、分枝期（7月20日）、現(xiàn)蕾期前（9月10日）、現(xiàn)蕾期（9月20日）．

每個(gè)處理的小區(qū)面積為15m2．配制0．4g／L YE溶液，按照300mL／m2用量均勻噴灑于苗葉片，對(duì)照組施用相同體積的蒸餾水．當(dāng)杭白菊頭狀花序中心小花60%開放時(shí)，采取杭白菊樣品，測(cè)定總還原力、·OH清除率和DPPH清除率．每個(gè)處理重復(fù)3次．

1．4．2 YE不同用量對(duì)杭白菊抗氧化活性的影響

試驗(yàn)設(shè)置0．1，0．2，0．3，0．4，0．5g／L 5種不同的YE濃度，同時(shí)設(shè)置空白（對(duì)照）．

以現(xiàn)蕾期前杭白菊為材料，每個(gè)處理的小區(qū)面積為15m2．配制0．1～0．5g／L YE溶液，按照300 mL／m2用量均勻噴灑于苗葉片．當(dāng)杭白菊頭狀花序中心小花60%開放時(shí)，取樣測(cè)定樣品的總還原力、·OH清除率和DPPH清除率．每個(gè)處理重復(fù)3次．

1．4．3 YE對(duì)杭白菊內(nèi)源NO水平的影響

現(xiàn)蕾期前以0．4g／L YE處理杭白菊，處理后1，2，3，4d分別取頂端第2～3葉片測(cè)定NO含量，以空白為對(duì)照．

1．4．4 NO淬滅劑對(duì)杭白菊內(nèi)源NO含量及藥效組分含量的影響

試驗(yàn)設(shè)為3組：1）0．5mmol／L cPTIO＋0．4g／L YE；2）0．4g／L YE；3）空白．

現(xiàn)蕾期前以0．5mmol／L cPTIO處理杭白菊，60min后再施以0．4g／L YE，處理后1，2，3，4d分別取頂端第2～3葉片測(cè)定NO含量．同時(shí)按照上述杭白菊采收標(biāo)準(zhǔn)分別采取處理組和對(duì)照組杭白菊（花）樣品，測(cè)定樣品的總還原力、·OH清除率和DPPH清除率．

1．5 測(cè)定方法

1．5．1 抗氧化活性測(cè)定

樣品提取液制備：杭白菊花經(jīng)105℃殺青15min、60℃烘干至恒重后研磨成粉狀過100目篩，裝袋備用．精密稱量0．25g干粉，用25mL的70%乙醇溶液超聲提取30min，過濾收集濾液，所得各濾液即各樣品提取液．

1．5．1．1 總還原力［14－15］

分別吸取1．0mL不同濃度的樣品溶液于10mL比色管中，加入0．2mol／L pH6．6的磷酸緩沖液2．5mL，再加入1%的鐵氰化鉀溶液2．5mL，搖勻后于50℃水浴中保溫30min，加入10%的三氯乙酸2．5mL終止反應(yīng)．取此溶液2．5mL，加入2．5mL的蒸餾水和0．5mL 0．1%的FeCl3溶液，充分混勻后靜置30min，700nm處測(cè)定吸光度．

1．5．1．2 ·OH清除率［16］

在25mL容量瓶中分別加入2mmol／L FeSO4溶液5mL，6mmol／L H2O2溶液5mL混勻，用6mmol／L水楊酸鈉定容，36℃水浴15min，冷卻后在510nm處測(cè)定吸光度A1．在上述體系中加入一定量提取液，36℃水浴15min，510nm處測(cè)其吸光度A2，按下式計(jì)算·OH清除率：清除率＝（A1－A2）／A1×100%．

1．5．1．3 DPPH清除率［17］

分別吸取4．0mL不同濃度的樣品溶液于10mL的比色管中，加入1．0mL 1mmol／L的DPPH溶液（無水乙醇配置），搖勻后于暗室中反應(yīng)30min，517nm處測(cè)定吸光度．同時(shí)測(cè)定維生素C、合成抗氧化劑TBHQ對(duì)DPPH自由基的清除率作為對(duì)比，按下式計(jì)算DPPH清除率：DPPH清除率＝｛1－（A1－A2）／A0｝×100%．其中：A1為加提取液后DPPH溶液的吸光度；A2為提取液的吸光度；A0為未加提取液時(shí)DPPH溶液的吸光度．

1．5．2 NO含量測(cè)定

依據(jù)NO與氧合血紅蛋白（HbO2）反應(yīng)生成高鐵血紅蛋白（MetHb）的原理，利用分光光度法測(cè)定氧合血紅蛋白（HbO2）因捕捉NO而發(fā)生的吸光度變化以表征樣品中NO含量［18］．通過測(cè)定消光系數(shù)為77mm－1cm－1（A401，HbO2，A421MetHb）時(shí)401，421nm處的吸光度值來確定氧合血紅蛋白（HbO2）轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白（MetHb）的量，從而計(jì)算NO的產(chǎn)生量［18］．具體操作步驟如下：分別取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照樣品（150mg鮮質(zhì)量）于研缽中，加入液氮、經(jīng)預(yù)冷處理的100mmol／L鉀－磷酸鹽緩沖液（pH＝7．0）及0．6%的聚乙烯吡咯烷酮迅速研磨成勻漿提取物，在提取物中加入活性炭后于4℃、11 000r／min下離心10min，取上清液經(jīng)0．45μmol／L聚四氟乙烯微孔膜過濾得樣品待測(cè)液，并按文獻(xiàn)［18］方法測(cè)定NO量．

1．6 統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析．所有數(shù)值均為3次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)的平均值±SE．采用t－test檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理組與對(duì)照組之間的差異顯著性，采用Tukey test檢測(cè)多個(gè)處理之間的差異顯著性．方差分析中P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果與討論

2．1 YE對(duì)杭白菊抗氧化活性的影響

2．1．1 YE不同使用時(shí)期對(duì)杭白菊抗氧化活性的影響

分別在杭白菊苗期、分枝期、現(xiàn)蕾期前期、現(xiàn)蕾期按300 mL／m2用量噴施YE（0．4g／L），并測(cè)定杭白菊樣品的總還原力、·OH清除率和DPPH清除率，以考查YE不同使用時(shí)期對(duì)杭白菊抗氧化活性的影響．試驗(yàn)結(jié)果表明，在分枝期、現(xiàn)蕾期前期、現(xiàn)蕾期施用YE均可顯著提高杭白菊總還原力、·OH清除率和DPPH清除率，其中以現(xiàn)蕾期前期和現(xiàn)蕾期使用效果最好（圖1）．由于現(xiàn)蕾前期使用YE對(duì)杭白菊生長(zhǎng)及產(chǎn)量無不利影響（表1），因此在后繼試驗(yàn)中選用現(xiàn)蕾前期作為YE處理時(shí)期．

表1 YE對(duì)杭白菊生長(zhǎng)及產(chǎn)量性狀的影響Tab．1 Effects of YE on growth of C．morifolium

在植物細(xì)胞培養(yǎng)研究中，酵母提取物是一種常用的誘導(dǎo)子．研究表明，將酵母誘導(dǎo)子添加到肉蓯蓉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中，能顯著提高抗氧化活性成分苯乙醇苷的含量［19］．張向東等用酵母提取物瞬時(shí)誘導(dǎo)黃芩懸浮細(xì)胞中的齊墩果酸和熊果酸的合成［20］．此外，酵母誘導(dǎo)子還可以顯著提高山柏、人參等懸浮細(xì)胞中次生活性物質(zhì)的含量［21－22］．本文首次報(bào)道了酵母提取物可以提高大田栽培杭白菊抗氧化活性，為酵母提取物在藥用植物栽培生產(chǎn)實(shí)踐中的運(yùn)用提供了直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

2．1．2 YE不同使用量對(duì)杭白菊抗氧化活性的影響

為進(jìn)一步考查YE使用濃度對(duì)杭白菊抗氧化活性的影響，筆者分別以0，0．1，0．2，0．3，0．4，0．5g／L YE處理現(xiàn)蕾前期杭白菊，并測(cè)定不同處理杭白菊的抗氧化活性．試驗(yàn)結(jié)果表明，0．2，0．3，0．4，0．5g／L YE處理均可以顯著提高杭白菊總還原力、·OH清除率和DPPH清除率（圖2），其中以0．4g／L YE處理效果最佳．與對(duì)照相比，現(xiàn)蕾前期使用0．4g／L YE可以使杭白菊總還原力、·OH清除率和DPPH清除率分別提高100．1%、151．7%、88．7%．

圖1 YE不同使用時(shí)期對(duì)杭白菊總還原力（a）、 ·OH清除率（b）和DPPH清除率（c）的影響Fig．1 Effects of different applying time on total reducing power（a），·OH scavenging capacity（b）and DPPH scavenging activity（c）of C．morifolium

2．2 YE依賴NO信號(hào)途徑提高杭白菊抗氧化活性

2．2．1 YE對(duì)杭白菊內(nèi)源NO的激活作用

由圖3可見，YE處理可以快速誘發(fā)杭白菊內(nèi)源NO迸發(fā)，在處理1d后杭白菊內(nèi)源NO水平升高到對(duì)照的5倍，說明YE可以激活杭白菊內(nèi)源NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑．

圖2 YE使用濃度對(duì)杭白菊抗氧化活性的影響Fig．2 Effects of YE concentrations on the antioxidant capacities of C．morifolium

圖3 YE及NO淬滅劑對(duì)杭白菊NO水平的影響Fig．3 YE－induced endogenous NO burst of C．morifolium

2．2．2 YE誘發(fā)杭白菊藥效組分合成積累對(duì)NO信號(hào)途徑的依賴性

為了進(jìn)一步考查YE誘發(fā)杭白菊抗氧化活性對(duì)NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的依賴性，測(cè)定了NO淬滅劑對(duì)YE處理的杭白菊中總還原力、·OH清除率和DPPH清除率的影響．cPITO是一種NO專一性淬滅劑，被廣泛用作植物中NO信號(hào)途徑的高效抑制劑［23］．本文試驗(yàn)結(jié)果表明，在YE處理前60min以0．5mmol／L cPTIO對(duì)杭白菊進(jìn)行預(yù)處理可以完全抑制YE對(duì)杭白菊內(nèi)源NO水平的提高作用（圖3），說明cPTIO預(yù)處理可以阻斷杭白菊內(nèi)源NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用．進(jìn)一步研究表明，cPTIO預(yù)處理可以顯著抑制YE對(duì)杭白菊總還原力、·OH清除率和DPPH清除率的促進(jìn)作用，而cPTIO處理組和對(duì)照組杭白菊的總還原力、·OH清除率和DPPH清除率無顯著差異（圖4），說明cPTIO本身對(duì)杭白菊抗氧化活性沒有影響．

圖4 NO淬滅劑對(duì)YE誘導(dǎo)杭白菊抗氧化性的抑制作用Fig．4 Inhibition of the NO scavenger on YE－enhanced antioxidant capacities of C．morifolium．

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，NO淬滅劑預(yù)處理在阻斷杭白菊內(nèi)源NO信號(hào)途徑的同時(shí)也抑制了YE對(duì)杭白菊抗氧化活性的促進(jìn)作用，說明NO是YE誘發(fā)杭白菊抗氧化活性提高所必需的信號(hào)分子．

綜上所述，本文試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)YE可以激活并依賴NO信號(hào)途徑促進(jìn)杭白菊抗氧化活性的提高．

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