“紅花末”色素理化特性及安全性分析

王忠合，王 軍，江曉東，蔡秋兒

（韓山師范學(xué)院 生物系，廣東 潮州 521041）

化學(xué)合成色素最早出現(xiàn)于十八世紀(jì)中期，由于食用合成色素的安全問(wèn)題，各國(guó)實(shí)際使用的品種數(shù)逐漸減少，其余尚可使用的種類、用量及使用范圍也都受到了嚴(yán)格的限制.近年來(lái)，人們已將目光轉(zhuǎn)向了天然色素，雖然在色素含量和穩(wěn)定性等方面不如化學(xué)合成品，但因其大多來(lái)自水果、蔬菜等資源，對(duì)人體的安全性較高.此外，很多天然色素易于吸收，本身又兼具保健功能，對(duì)于癌癥、心臟病、眼科疾病等具有較好的預(yù)防效果[1-4].

“紅花末”色素，又稱為“胭米”紅色素，是潮汕制作紅桃粿等潮汕小吃時(shí)常用的一種色素[5,6]，在潮汕風(fēng)俗小吃中“紅花末”色素普遍使用，潮汕人為了追求吉祥，在一些米粿上涂一點(diǎn)“紅花末”色素，所以“紅花末”色素在潮汕地區(qū)的民俗文化和小吃中處在一個(gè)舉足輕重的位置.由于在傳統(tǒng)方法制作中使用的“紅花末”色素應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)，且多為民間生產(chǎn)，無(wú)法考證其具體來(lái)源，相關(guān)的研究文獻(xiàn)也非常少，其所含化學(xué)成份尚未闡明，但是因其色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、著色力強(qiáng)、成本低廉，在糕點(diǎn)上彩裝領(lǐng)域應(yīng)用范圍非常廣，機(jī)體攝入后對(duì)人體健康的影響也未知，因此關(guān)于其安全性研究就十分必要.

本實(shí)驗(yàn)首先分析該色素的理化特性，再依據(jù)我國(guó)食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法（GB 15193-2003）的規(guī)定[7]，進(jìn)行第一階段的急性毒性試驗(yàn)和第二階段的遺傳毒性試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)“紅花末”色素的安全性，旨在為該色素的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“紅花末”色素，購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng).秋水仙素、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、吉姆薩染料、甘油、甲醇、冰醋酸、伊紅、氯化鈉，瓊脂、牛肉膏、蛋白胨等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；X52-H顯微鏡配照相系統(tǒng)（北京泰克儀器有限公司）；AUW120型電子天平（SHIMADZU（日本）公司）等.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 圖譜掃描

配制0.02mg/mL的色素水溶液，掃描200～800 nm的吸收?qǐng)D譜，確定色素溶液的特征吸收峰.

1.3.2 色素穩(wěn)定性試驗(yàn)

（1）溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

在每支具塞試管中稱取0.5mg色素，用蒸餾水定容至25mL，分別在34、54、74℃下保溫，每隔90min取樣，冷卻至25℃，測(cè)定色素溶液的吸光度，比較溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響.

（2）光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

在每支具塞試管中稱取0.5mg色素，蒸餾水定容至25mL，分別置于暗處、日光燈下、紫外燈下，每隔60min取樣，冷卻至25℃，測(cè)量色素溶液的吸光度，比較光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響.

1.3.3 色素毒理學(xué)檢測(cè)

（1）急性毒性試驗(yàn)

采用寇氏法[7，8]測(cè)定色素對(duì)小鼠的LD50值，取體重18～20 g的健康Wistar小鼠30只，隨機(jī)分為5組，雌雄各半.小鼠隔夜空腹，禁食16 h，不限制飲水，實(shí)驗(yàn)組采用6個(gè)對(duì)數(shù)等距的劑量，每只按0.4mL/20 g體重灌胃，空白組給水對(duì)照.觀察2周，記錄小鼠死亡情況，計(jì)算LD50值.

（2）小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)

選擇性成熟的雄小鼠25只（體重25～30 g），隨機(jī)分為5組，每組5只，試驗(yàn)組以1/8、1/4、1/2 LD50值為低、中、高劑量組，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組（蒸餾水）和陽(yáng)性對(duì)照組（秋水仙素0.4mg/kg·bw，腹腔注射1次）.每天灌胃1次，連續(xù)灌胃5 d，各組均于第一次給予受試物后第21 d用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，取出兩側(cè)附睪，放入盛有適量生理鹽水的小燒杯中，用眼科剪將附睪縱向剪兩刀，靜置3～5min，輕輕搖動(dòng).用四層擦鏡紙過(guò)濾，吸濾液涂片，于空氣中干燥后，用甲醇固定5min以上干燥.用1%～2%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥后在低倍鏡下（用綠色濾光片）找背景清晰、精子重疊較少的部位，用高倍鏡檢查精子形態(tài)，計(jì)數(shù)結(jié)構(gòu)完整的精子.精子有頭無(wú)尾（輪廓不清）或頭部與其他精子或碎片重疊，或明顯是人為剪碎者，均不計(jì)算.每只小鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)精子，記錄畸變精子數(shù)，計(jì)算畸變率.

1.3.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析其差異性.

2 結(jié)果與分析

2.1 圖譜掃描結(jié)果

“紅花末”色素水溶液吸收光譜如圖1所示.

圖 1 色素水溶液的吸收光譜圖

由圖1可知，“紅花末”色素溶液在200～800 nm之間有5個(gè)吸收峰，分別在230、260、270、360、560 nm處，可見(jiàn)區(qū)的特征吸收峰為560 nm，其成分及其化學(xué)結(jié)構(gòu)還有待于進(jìn)一步研究.在接下來(lái)的穩(wěn)定性試驗(yàn)中測(cè)定吸光度的波長(zhǎng)選定560 nm.

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別考察溫度和光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響，色素殘存率隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.從圖2（a）可以看出，該色素的熱穩(wěn)定性較好，可耐受長(zhǎng)時(shí)間的加熱處理.隨著加熱溫度的升高，該色素的最大降解率小于2%，這也與該色素用于糕點(diǎn)上彩裝時(shí)在蒸制過(guò)程中仍能保持較好的色澤結(jié)果一致.因此，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響不明顯（p＞0.05）.從圖2（b）可以看出，在不同的光照情況下，光照對(duì)色素的穩(wěn)定性的影響不明顯，但在處理2 h后，光照對(duì)色素的穩(wěn)定性的影響差異較大，紫外光對(duì)色素的破壞作用最大，這可能與色素對(duì)紫外光敏感有關(guān).

圖 2 色素的熱穩(wěn)定性（a）和光穩(wěn)定性（b）

2.3 急性毒性試驗(yàn)

小鼠灌胃后，耳朵、尾巴、眼眶、爪子立即變紅，3 h后排出的糞便呈紅色，如圖3所示；劑量大于1 000mg/kg·bw的實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃4 h后出現(xiàn)眼球外凸、反應(yīng)遲鈍、靜呆在角落里，5 h后出現(xiàn)打滾掙扎的現(xiàn)象，6.5 h后死亡；48 h剩余小鼠身上仍有較淺的紅色、糞便也呈較淺的紅色.死亡的小鼠解剖發(fā)現(xiàn)肝臟為黑色，表面有些地方是粉色，而心臟、胃、腸等都是紅色，胃和食道沒(méi)有出現(xiàn)穿孔的現(xiàn)象，由此確定小鼠是由于色素中毒死亡的，而非灌胃操作不當(dāng)引起的.根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果和國(guó)家急性毒性實(shí)驗(yàn)方法，采用10～3 162mg/kg·bw的劑量灌胃，按照寇氏法計(jì)算，“紅花末”色素LD50值為1 259mg/kg·bw，參照國(guó)家急性毒性劑量分級(jí)，可以認(rèn)為該色素屬于低毒級(jí)，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格限制其用量.

圖 3 小鼠灌胃后變紅的部位（a）及其排泄物（b）

2.4 小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)

小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果如表1所示.由結(jié)果可知，“紅花末”色素誘導(dǎo)小鼠精子畸變率試驗(yàn)中，三種劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組間對(duì)小鼠精子畸變率與陰性對(duì)照組之間有顯著差異（p＜0.05），畸變精子中無(wú)定形、尾折疊、雙尾、香蕉形、無(wú)鉤、雙頭等畸變精子如圖4所示.小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)所反映的遺傳學(xué)終點(diǎn)主要是對(duì)生殖細(xì)胞的遺傳毒性進(jìn)行評(píng)估，而且精子畸變率升高從本質(zhì)上也能代表一定的生殖毒理學(xué)意義[8-10].遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，“紅花末”色素在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，對(duì)小鼠精子有明顯的致突變作用，所以在使用中需嚴(yán)格限制其用量，或者使用食用天然色素代替，有關(guān)其遺傳毒性試驗(yàn)還需進(jìn)一步研究證實(shí).

表1 色素對(duì)小鼠精子畸變率的影響

圖 4 畸變精子圖

3 結(jié)論

（1）“紅花末”色素在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有五個(gè)吸收峰，分別為230、260、270、360、560 nm，在可見(jiàn)區(qū)的特征吸收峰是560 nm處，色素光穩(wěn)定性較差，熱穩(wěn)定性較好.

（2）急性毒性試驗(yàn)表明，“紅花末”色素半數(shù)致死量（LD50）值為：1 259mg/kg·bw，屬于低毒級(jí).小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果表明該色素具有一定的致突變性，使用中應(yīng)注意其用量.

（3）“紅花末”色素雖然其應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)，但其安全性研究報(bào)道較少，本研究發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，“紅花末”色素對(duì)小鼠精子的畸變率較高，長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)人類的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響，關(guān)于其安全性需深入研究.

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