卷煙全煙氣直接暴露方法的研究進(jìn)展

夭建華, 胡明陽(yáng), 米其利, 黃海濤, 唐萍，李雪梅,繆明明

1云南煙草科學(xué)研究院，昆明市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科醫(yī)路41號(hào) 650106；

2昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明市呈貢新區(qū)景明南路727號(hào) 650500

通常在毒理學(xué)試驗(yàn)中，染毒方式對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有重要的影響。在采用細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）、體外細(xì)胞微核試驗(yàn)和中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)[1-4]進(jìn)行煙用添加劑安全性評(píng)價(jià)和卷煙煙氣毒理學(xué)評(píng)價(jià)中，目前國(guó)內(nèi)外煙草公司及相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)[5-7]均是采用吸煙機(jī)抽吸卷煙、劍橋?yàn)V片捕集煙氣總粒相物，再用二甲基亞砜（DMSO）將劍橋?yàn)V片上的煙氣總粒相物萃取出來后，與細(xì)菌或細(xì)胞一起培養(yǎng)，來檢測(cè)主流煙氣總粒相物的遺傳毒性或細(xì)胞毒性。這種經(jīng)典方法的優(yōu)點(diǎn)是煙氣樣品可以保存大約幾個(gè)月的時(shí)間，缺點(diǎn)是不能真正地反映新鮮煙氣的物理和化學(xué)特征，因?yàn)樵谶@種測(cè)試中對(duì)煙氣氣相組分的關(guān)注很少，粒相物、氣相物和揮發(fā)性物質(zhì)間的相互作用也沒有被考慮，另外，煙氣長(zhǎng)時(shí)間放置后，化學(xué)成分發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定。因此，全煙氣直接暴露法就應(yīng)運(yùn)而生。

卷煙全煙氣直接暴露方法是一種借鑒氣體染毒特點(diǎn)而建立的應(yīng)用于卷煙煙氣細(xì)菌和細(xì)胞染毒的新方法。1999年，德國(guó)Fraunhofer毒理學(xué)和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所的Aufderheide等首次報(bào)道了將細(xì)胞培養(yǎng)在氣液界面進(jìn)行氣體暴露的Cultex細(xì)胞培養(yǎng)裝置和技術(shù)[8]，該技術(shù)被用于氣體的細(xì)胞毒性研究。后來為適應(yīng)卷煙煙氣的毒性研究，開發(fā)了和吸煙機(jī)連接的整套系統(tǒng)，即卷煙全煙氣暴露系統(tǒng)裝置。

在卷煙全煙氣直接暴露法中，將卷煙經(jīng)吸煙機(jī)抽吸產(chǎn)生的全部煙氣即時(shí)與空氣稀釋后，直接通入到培養(yǎng)有鼠傷寒沙門氏菌或測(cè)試細(xì)胞的暴露容器中，煙氣與位于氣液界面（air/liquid interface）的細(xì)菌或細(xì)胞直接接觸來達(dá)到全煙氣暴露的目的，暴露后的細(xì)菌或細(xì)胞可繼續(xù)進(jìn)行毒理學(xué)效應(yīng)的測(cè)試，例如進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)、微核試驗(yàn)和Ames試驗(yàn)等。全煙氣暴露濃度用稀釋后的煙氣中TPM濃度作為指標(biāo)進(jìn)行控制。這種暴露方式使卷煙煙氣處于相對(duì)“原始”（native）的狀態(tài)，能相對(duì)模擬人吸煙時(shí)人體細(xì)胞接觸煙氣的情況，因而更能及時(shí)反映出細(xì)菌或細(xì)胞暴露于全煙氣成分中的真實(shí)情況。因此，全煙氣暴露方法作為一種新方法和新技術(shù)，正引起國(guó)內(nèi)外煙草科研人員的關(guān)注。近幾年，在CORESTA和TSRC會(huì)議上關(guān)于該研究的交流論文較多[9-15]。目前，CORESTA體外毒理學(xué)小組也在積極進(jìn)行全煙氣直接暴露方法的研究，并組織了相關(guān)的共同試驗(yàn)和學(xué)術(shù)交流[16]。

卷煙全煙氣直接暴露研究的核心是暴露裝置和條件。由于卷煙全煙氣直接暴露方法是將培養(yǎng)的細(xì)胞暴露到煙氣中，因此，在體外暴露系統(tǒng)設(shè)計(jì)中必須實(shí)現(xiàn)以下要點(diǎn)[17]：（1）受試氣體產(chǎn)生的精確控制；（2）受試氣體的暴露時(shí)間和物理化學(xué)特性的精確控制；（3）細(xì)胞或細(xì)菌和受試氣體盡可能緊密接觸；（4）系統(tǒng)設(shè)計(jì)應(yīng)該利于其暴露時(shí)間的擴(kuò)展，一般細(xì)胞暴露于環(huán)境空氣中，會(huì)由于干燥而導(dǎo)致鈍化，因此暴露裝置應(yīng)該有溫度和濕度維持系統(tǒng)來保證細(xì)胞或細(xì)菌的正常生長(zhǎng)；（5）暴露后可以測(cè)定有代表性的終點(diǎn)，就像在動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)一樣，必須有可以分析毒理學(xué)效應(yīng)的標(biāo)志物。

目前報(bào)道的卷煙全煙氣直接暴露方法中，測(cè)試細(xì)胞或細(xì)菌與煙氣的接觸方式主要有兩種類型，一種是氣液界面接觸式，即測(cè)試細(xì)胞或細(xì)菌處于相對(duì)固定狀態(tài)（測(cè)試細(xì)胞處于貼壁狀態(tài)，測(cè)試細(xì)菌被涂布在固體培養(yǎng)基上），一種是氣液接觸式，即測(cè)試細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，煙氣通入細(xì)胞懸浮液中達(dá)到煙氣暴露的目的。商品化裝置日本的Cultex[18]和德國(guó)的Vitrocell[19]，這兩種設(shè)備基本相同，暴露方式均是氣液界面接觸式。IT公司（Imperial Tobacco UK）設(shè)計(jì)的卷煙全煙氣細(xì)胞暴露裝置是基于氣液接觸式暴露方式[16]。

1 氣液界面接觸式煙氣暴露方式

基于貼壁細(xì)胞的氣液界面接觸式煙氣暴露方式是將卷煙煙氣直接通入培養(yǎng)于半透膜上的測(cè)試細(xì)胞，使測(cè)試細(xì)胞與煙氣處于氣液界面上而達(dá)到煙氣暴露的目的。目前，采用此種暴露方式的暴露裝置有兩類，一類是商品化的暴露裝置，如日本的Cultex[18]和德國(guó)的Vitrocell[19]，一類是煙草研究機(jī)構(gòu)自行設(shè)計(jì)的暴露裝置，如BAT煙草公司的暴露裝置[20]，以及美國(guó)Battelle公司[16]和鄭州煙草研究院的暴露裝置[21]。

1.1 Cultex和Vitrocell的氣液界面接觸式煙氣暴露方式

1.1.1 暴露原理

由于Vitrocell[19]和Cultex全煙氣暴露系統(tǒng)裝置的工作原理和基本構(gòu)造相同，Cultex的開發(fā)早于Vitrocell，且Cultex的報(bào)道較為系統(tǒng)，因此以Cultex為例介紹此類煙氣暴露方法。Cultex的暴露原理是將測(cè)試細(xì)胞或細(xì)菌固定在基質(zhì)上，再進(jìn)行煙氣暴露，即將細(xì)胞種植transwell小室（porous transwellTM）的底部有孔膜上，將細(xì)菌涂布在固體培養(yǎng)基上。暴露裝置由吸煙機(jī)、煙氣稀釋分配系統(tǒng)、培養(yǎng)基供應(yīng)系統(tǒng)、培養(yǎng)基溫度維持系統(tǒng)以及細(xì)胞/細(xì)菌暴露裝置共五個(gè)部分組成[18-19]。圖1所示的是Vitrocell全煙氣暴露裝置的工作示意圖。用于貼壁細(xì)胞的煙氣暴露時(shí)，將細(xì)胞種植于一種特殊的可轉(zhuǎn)移的transwell小室（porous transwellTM）的底部膜上，小室底部接觸培養(yǎng)液，煙氣從煙氣稀釋分配系統(tǒng)進(jìn)入暴露腔，和transwell小室上的細(xì)胞接觸后，由廢氣出口流出，完成煙氣的細(xì)胞暴露反應(yīng)。暴露一定時(shí)間后，取出transwell小室，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞毒性指標(biāo)試驗(yàn)[20]。因此，細(xì)胞是位于氣-液界面上進(jìn)行煙氣暴露，煙氣直接接觸細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)全煙氣的暴露。

圖1 商品化全煙氣細(xì)胞暴露裝置工作示意圖（摘自文獻(xiàn)[18-19]，略作修改）

用于Ames試驗(yàn)的暴露裝置其原理和裝置構(gòu)造與細(xì)胞暴露的相似，只是用培育有細(xì)菌的培養(yǎng)皿代替種植細(xì)胞的transwell小室，直接將培養(yǎng)皿置于煙氣暴露腔中進(jìn)行煙氣暴露，暴露一定時(shí)間后，將培養(yǎng)皿取出繼續(xù)進(jìn)行Ames試驗(yàn)[22]。

1.1.2 應(yīng)用研究

國(guó)外各研究機(jī)構(gòu)關(guān)于Cultex和Vitrocell暴露裝置在煙草煙氣毒理學(xué)評(píng)價(jià)中的可行性研究和應(yīng)用研究較為深入和全面，并取得了較好結(jié)果。Roper等研究了全煙氣暴露對(duì)細(xì)胞的溶酶體活性（中性紅攝入法）和代謝活性（MTS代謝活性法）的影響，測(cè)試結(jié)果顯示全煙氣暴露方法可行，數(shù)據(jù)可靠[9]。Eguchi等使用Cultex暴露裝置研究了不同卷煙煙氣對(duì)A549人肺上皮細(xì)胞的毒性作用，得出結(jié)論全煙氣暴露裝置是評(píng)價(jià)卷煙煙氣生物學(xué)活性的有效方式[10]。Fukano等使用Cultex暴露裝置得到的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，煙氣對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的作用大小主要由抽吸口數(shù)和煙氣濃度決定[12]。Nishino等利用Cultex暴露裝置研究了傳統(tǒng)煙氣捕集方法所忽略的煙氣組分-非水溶性氣相物，并用中性紅攝入法評(píng)價(jià)了非水溶性氣相物的細(xì)胞毒性[13]；此外，他們還利用Cultex全煙氣暴露裝置進(jìn)行了全煙氣暴露下體外微核法的研究，結(jié)果表明全煙氣暴露下誘發(fā)的細(xì)胞微核率明顯高于傳統(tǒng)捕集方法萃取得到的煙氣樣品所誘發(fā)的細(xì)胞微核率[14]。Aufderheide等應(yīng)用全煙氣暴露法研究了卷煙煙氣對(duì)于鼠傷寒沙門氏菌的誘變性，結(jié)果顯示，相比較于傳統(tǒng)的煙氣測(cè)試方法，全煙氣暴露下細(xì)菌誘變的敏感性提高了[15]。Ritter等采用全煙氣暴露法比較了不同卷煙煙氣的細(xì)胞毒性情況，結(jié)果表明全煙氣暴露法在評(píng)價(jià)不同類型卷煙的細(xì)胞毒性差異方面具有可行性[23]。Olivera等研究發(fā)現(xiàn)，全煙氣暴露下人支氣管上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)及其通透性發(fā)生改變[24]。Roller等應(yīng)用Ames試驗(yàn)結(jié)合全煙氣暴露法，對(duì)6種卷煙煙氣的致突變性數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果表明全煙氣暴露法適用于卷煙煙氣的致突變性評(píng)價(jià)[25]。

1.1.3 優(yōu)缺點(diǎn)

此類暴露裝置在煙草全煙氣分析及環(huán)境氣體分析中有著廣泛的應(yīng)用，已經(jīng)商品化，裝置和使用方法較為規(guī)范，并且能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、組織以及細(xì)菌的直接暴露，檢測(cè)結(jié)果具有劑量-反應(yīng)關(guān)系。但是，此類暴露裝置價(jià)格昂貴，普通實(shí)驗(yàn)室難以負(fù)擔(dān)，這也在一定程度上限制了此類裝置的推廣和普及。

1.2 BAT公司的氣液界面接觸式煙氣暴露方式

1.2.1 暴露原理

BAT公司（British American Tobacco）自行開發(fā)設(shè)計(jì)了用于細(xì)胞毒性測(cè)試的連接吸煙機(jī)的細(xì)胞暴露裝置[16]，見圖2，其暴露原理同Cultex的細(xì)胞暴露原理基本相同，細(xì)胞種植于transwell小室（porous transwellTM）的半透膜上，其下以一定流速的培養(yǎng)液為其提供基本生活條件，細(xì)胞位于氣-液界面上暴露，煙氣直接接觸細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)全煙氣暴露。

1.2.2 應(yīng)用研究

BAT公司使用此暴露裝置，將人肺上皮細(xì)胞暴露于卷煙全煙氣中，研究了卷煙全煙氣對(duì)人肺上皮細(xì)胞的毒性作用[26]，并且通過此煙氣暴露裝置研究了卷煙全煙氣的生成及評(píng)價(jià)方面的注意事項(xiàng)[27]。Massey等將哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于3R4F卷煙的一系列稀釋煙氣后用體外微核試驗(yàn)（雙核法）來檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性與稀釋劑量有相關(guān)性，而微核誘導(dǎo)作用明顯缺乏劑量響應(yīng)[11]。

圖2 BAT公司全煙氣細(xì)胞暴露裝置示意圖（圖片摘自文獻(xiàn)[16]，略作修改）

1.2.3 優(yōu)缺點(diǎn)

BAT公司自行開發(fā)的全煙氣暴露裝置構(gòu)造簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)合理，和Cultex和Vitrcell一樣，采用了transwell小室來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的培養(yǎng)，可以達(dá)到全煙氣暴露實(shí)驗(yàn)的要求，有很好的應(yīng)用前景。

1.3 Battelle公司的氣液界面接觸式煙氣暴露方式

1.3.1 暴露原理

美國(guó)Battelle公司實(shí)驗(yàn)室用細(xì)胞培養(yǎng)瓶改裝制作了簡(jiǎn)單且易操作的全煙氣暴露裝置[16]，如圖3所示，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用潔凈空氣稀釋的煙氣以一定流速通入種有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，振蕩器左右振蕩一定的角度使培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液左右流動(dòng)從而使細(xì)胞與煙氣進(jìn)行直接接觸暴露，達(dá)到全煙氣直接暴露的目的。暴露一定時(shí)間后，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。在這種暴露方式中，煙氣并不是完全直接和細(xì)胞接觸，會(huì)有部分培養(yǎng)液殘留，從而煙氣會(huì)有部分在培養(yǎng)液中，細(xì)胞的暴露方法介于Cultex和IT公司開發(fā)的裝置（見2.1）的暴露方式之間。

1.3.2 應(yīng)用研究

盧斌斌等采用Battelle公司裝置進(jìn)行了全煙氣暴露法研究，比較了3種不同焦油含量的卷煙煙氣的細(xì)胞毒性[21]，見圖4。在該研究中，暴露時(shí)間為60 min，每個(gè)樣品通過調(diào)節(jié)空氣與煙氣的稀釋比例暴露6個(gè)濃度（15～150μg/L），每個(gè)濃度6個(gè)平行樣品，6個(gè)對(duì)照樣品。整個(gè)暴露過程根據(jù)監(jiān)測(cè)的TPM/L值進(jìn)行控制。暴露結(jié)束后，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液換成新鮮的培養(yǎng)液，并置于CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h。對(duì)照為6個(gè)通入潔凈空氣并經(jīng)過相同條件培養(yǎng)的平行樣品。測(cè)試結(jié)果顯示，隨著煙氣暴露濃度的增大，卷煙煙氣引起細(xì)胞死亡數(shù)量增大。上述研究結(jié)果提示，Battelle公司暴露裝置可用于卷煙煙氣的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。

圖3 Battelle公司自行改裝的全煙氣暴露瓶（圖片摘自文獻(xiàn)[16]，略作修改）

圖4 鄭州煙草研究院的全煙氣暴露裝置（圖片摘自文獻(xiàn)[21]）

1.3.3 優(yōu)缺點(diǎn)

由細(xì)胞培養(yǎng)瓶改造而成的全煙氣暴露裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易操作，在普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)，可以滿足實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)單的細(xì)胞全煙氣暴露的相關(guān)研究。由目前的研究?jī)?nèi)容來看，該暴露裝置僅限于煙氣對(duì)細(xì)胞的影響作用研究，未見更為系統(tǒng)和深入的文獻(xiàn)報(bào)道。

2 氣液兩相接觸式煙氣暴露方式

關(guān)于氣液兩相接觸式煙氣暴露方式，目前僅見IT公司的報(bào)道。

2.1 暴露原理

IT公司設(shè)計(jì)和制作了直接將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行全煙氣暴露的裝置[16]，如圖5所示，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)培養(yǎng)孔底部，經(jīng)清潔空氣稀釋后的煙氣通過類似煙氣注射的方式通到每個(gè)培養(yǎng)孔中，暴露一定時(shí)間后，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出后繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)。這種暴露方式和Cultex不一樣，煙氣是通過培養(yǎng)液中與細(xì)胞接觸，從而實(shí)現(xiàn)全煙氣的暴露。

圖5 IT公司全煙氣細(xì)胞暴露裝置示意圖（圖片摘自文獻(xiàn)[16]，略作修改）

2.2 應(yīng)用研究

Wieczorek等應(yīng)用上述裝置，將培養(yǎng)有人肺上皮細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板直接暴露于全煙氣中，證明了96孔細(xì)胞培養(yǎng)板用于全煙氣暴露的可行性[28]。Achard等應(yīng)用上述裝置研究了不同卷煙的全煙氣毒性，采用中性紅攝入法比較了其細(xì)胞毒性，并用彗星試驗(yàn)比較了其遺傳毒性，研究了濾嘴對(duì)于煙氣毒性的影響,結(jié)果表明，中性紅攝入法和彗星試驗(yàn)結(jié)合全煙氣暴露裝置可以有效評(píng)價(jià)不同卷煙煙氣的細(xì)胞毒性和遺傳毒性[29]。

2.3 優(yōu)缺點(diǎn)

IT公司開發(fā)的全煙氣暴露裝置專用于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞的全煙氣直接暴露，操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求也不是很高，而且因?yàn)橹苯邮褂?6孔細(xì)胞培養(yǎng)板暴露，對(duì)煙氣暴露試驗(yàn)的后期中性紅攝入法處理比較方便。

3 煙氣暴露量的控制及表征

在全煙氣暴露裝置中，煙氣的暴露劑量控制非常關(guān)鍵[30]。在Cultex和Vitrocell暴露裝置中，煙氣的暴露劑量通過稀釋分配系統(tǒng)控制。吸煙機(jī)抽吸卷煙產(chǎn)生的新鮮煙氣以一定的抽吸容量被壓入稀釋系統(tǒng)中，經(jīng)流速恒定的清潔空氣稀釋后以一定的速度經(jīng)過暴露腔。清潔空氣的流速由氣體流量控制器和真空管控制，經(jīng)過暴露腔的經(jīng)清潔空氣稀釋的煙氣流速由真空泵產(chǎn)生的負(fù)壓和氣體流量控制器控制。

煙氣暴露劑量根據(jù)進(jìn)入暴露腔中的量計(jì)算，根據(jù)公式1以煙氣百分比表示。公式中的分子是最終經(jīng)過暴露腔的煙氣流速；分母是煙氣和清潔空氣的流速，即經(jīng)過稀釋系統(tǒng)的總煙氣的流速。

公式1（摘自文獻(xiàn)[22]）：

美國(guó)Battelle公司的全煙氣暴露裝置煙氣暴露劑量是通過不同流速潔凈空氣對(duì)主流煙氣進(jìn)行稀釋從而使細(xì)胞暴露于不同濃度的煙氣實(shí)現(xiàn)的。煙氣暴露濃度以稀釋后的煙氣中總粒相物（TPM）濃度為指標(biāo)進(jìn)行控制[21]。在ISO標(biāo)準(zhǔn)條件下抽吸卷煙，產(chǎn)生的主流煙氣用潔凈空氣稀釋，稀釋后的煙氣直接導(dǎo)入盛有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中。煙氣暴露濃度以稀釋后的煙氣中總粒相物（TPM）濃度為指標(biāo)進(jìn)行控制。

4 全煙氣暴露試驗(yàn)的重要影響因素分析

由于Cultex暴露裝置被廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性物質(zhì)毒理研究和環(huán)境空氣的研究，對(duì)其的研究較為系統(tǒng)深入，Aufderheide等對(duì)Cultex暴露系統(tǒng)進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)十年的研究，發(fā)表了許多研究論文，內(nèi)容涵蓋全煙氣暴露試驗(yàn)的重要影響因素研究、應(yīng)用Cultex暴露裝置進(jìn)行混合氣體和煙氣的毒理學(xué)研究等。

4.1 空氣流速

Aufderheide等使用Cultex暴露裝置，研究了空氣流速對(duì)細(xì)胞存活率的影響[8]。將人肺成纖維細(xì)胞暴露于含有20.5%的氧氣和氮?dú)饨M成的空氣中5-120 min，流速分別為 667、33、16.7、12.7和 8.3 mL/min，反應(yīng)條件為25℃，90%相對(duì)濕度，沒有二氧化碳。結(jié)果顯示，隨著測(cè)試氣體流速的降低，細(xì)胞存活率急劇升高。由此可見，氣體流速會(huì)對(duì)細(xì)胞的存活率產(chǎn)生一定的影響。因此，進(jìn)行煙氣暴露試驗(yàn)時(shí)應(yīng)充分考慮煙氣的通入速率。

4.2 試驗(yàn)溫度

Knebel等研究發(fā)現(xiàn)在復(fù)雜氣體暴露試驗(yàn)中，全煙氣暴露系統(tǒng)中的反應(yīng)腔溫度由25℃提高到37℃時(shí)，由于清潔空氣會(huì)產(chǎn)生較大的蒸發(fā)，引起了細(xì)胞存活率的降低[31]。因此，進(jìn)行煙氣暴露試驗(yàn)時(shí)應(yīng)充分考慮溫度對(duì)暴露體系和檢測(cè)結(jié)果的影響。

4.3 Ames試驗(yàn)中頂部培養(yǎng)層的厚度

Aufderheide等發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)研究中，細(xì)菌存活率和頂部培養(yǎng)層體積呈正相關(guān)性，即隨著頂層培養(yǎng)基體積的增大，細(xì)菌存活率隨著升高。通過分析還發(fā)現(xiàn)直接涂布法和瓊脂覆層法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果有較大影響，并且可以得到結(jié)論：用瓊脂覆層法比直接涂布法獲得陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果較少，兩者區(qū)別明顯[32]。

4.4 吸煙機(jī)和暴露裝置間的距離

Aufderheide等認(rèn)為由于煙氣成分復(fù)雜，在其產(chǎn)生后有可能發(fā)生各種組分間的化學(xué)反應(yīng)，為避免煙氣老化，最好能在煙氣產(chǎn)生的10秒內(nèi)到達(dá)暴露腔內(nèi)[8]。

4.5 Ames試驗(yàn)測(cè)試菌株的質(zhì)粒

Aufderheide等研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒PKM101對(duì)測(cè)試菌株的回復(fù)突變有著重要作用。在檢測(cè)全煙氣的致突變性時(shí)，質(zhì)粒pKM101是必需的，在移碼突變中的作用比在錯(cuò)義突變中的更大[32]。

4.6 代謝活化系統(tǒng)S9

Aufderheide等在細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，同一平行試驗(yàn)中，是否加入30%的S9，對(duì)陽(yáng)性結(jié)果有著顯著影響，其陽(yáng)性結(jié)果中細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)的差距可達(dá)數(shù)十倍[32]。

從以上的分析可以看出，全煙氣暴露試驗(yàn)中存在著較多的影響因素，因此在進(jìn)行全煙氣暴露試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)充分考慮上述影響因素對(duì)檢測(cè)體系和結(jié)果的影響。

5 討論與展望

在全煙氣暴露方法中，煙氣暴露量的控制和監(jiān)測(cè)是一個(gè)研究難點(diǎn)，各國(guó)科學(xué)家正在努力攻關(guān)[8,22,27,34]。目前所采用的方法主要是分別對(duì)煙氣的粒相成分和氣相成分以及其他煙氣中的單一物質(zhì)（例如甲醛等）進(jìn)行測(cè)定，但不能實(shí)現(xiàn)全煙氣暴露量的在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。德國(guó)CULTEX實(shí)驗(yàn)室研究人員對(duì)Cultex暴露裝置的煙氣沉降以及煙氣濃度監(jiān)測(cè)進(jìn)行了大量研究，例如為測(cè)定粒相物在細(xì)菌平皿中的沉降情況，采用將劍橋?yàn)V片捕集的粒相物經(jīng)甲醇萃取后測(cè)定萃取液的Ex/Em（355nm/485nm）值，結(jié)果表明，粒相物在細(xì)菌平皿中的沉降效率取決于暴露小室內(nèi)的氣體流速；使用散射光裝置和一氧化碳和/或二氧化碳（CO和/或CO2）分析儀分別在線監(jiān)測(cè)了在Cultex暴露裝置中卷煙側(cè)流煙氣的粒相物和CO和/或CO2（用來表征氣相物）的濃度，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)過程中不同稀釋倍數(shù)的側(cè)流煙氣的濃度具有重復(fù)性和穩(wěn)定性[17,22,35,36]。在CORESTA體外毒理學(xué)小組2011年4月和10月兩次會(huì)議上，各家實(shí)驗(yàn)室對(duì)全煙氣暴露中使用散射光裝置或CO分析儀以及其他煙氣中的單一物質(zhì)監(jiān)測(cè)煙氣濃度進(jìn)行了討論。隨著各實(shí)驗(yàn)室研究的深入，研究人員可以緊密跟蹤并了解這個(gè)新領(lǐng)域新方向的研究進(jìn)展情況。

總之，盡管全煙氣暴露方法還存在很多需要改進(jìn)和優(yōu)化的地方，但作為一種比傳統(tǒng)方法更為客觀和直接的卷煙煙氣暴露方式，相信該方法會(huì)在不久的將來，被越來越多的煙草公司、研究機(jī)構(gòu)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)所關(guān)注，使該方法能更好地為低危害卷煙毒理學(xué)評(píng)價(jià)和煙用添加劑安全性評(píng)價(jià)服務(wù)。

[1] Baker R B, Massey E D, Smith G. An overview of the effects of tobacco ingredients on smoke chemistry and toxicity [J].Food and chemical Toxicology, 2004, 42S: 53-83.

[2] Roemer E, Tewes F J，Meisgen T J, et al. Evaluation of the potential effects of ingredients added to cigarettes. Part 3: In vitro genotoxicity and cytotoxicity [J]. Food and chemical toxicology, 2002, 40(1): 105-111.

[3] Andreoli C, Gigante D, Nunziata A. A review of in vitro methods to assess the biological activity of tobacco smoke with the aim of reducing the toxicity of smoke [J]. Toxicology in vitro, 2003, 17(5): 587-594.

[4] Rickert w S, Trivedi A H, Momin R A, et al. Effect of smoking conditions and methods of collection on the mutagenicity and cytotoxicity of cigarette mainstream smoke. Toxicological sciences, 2007, 96(2): 285-293,

[5] Canada Health official Method T-501. Bacterial reverse mutation assay for mainstream tobacco smoke [S]. Second Edition 2004-11-01.

[6] Canada Health off i cial Method T-502. Neutral red uptake assay for mainstream tobacco smoke [S]. Second Edition 2004-11-01.

[7] Canada Health off i cial Method T-503. In vitro micronucleus assay for mainstream tobacco smoke [S]. Second Edition 2004-11-01.

[8] Aufderheide M, Mohr U. Cultex--a new system and technique for the cultivation and exposure of cells at the air/liquid interface [J]. Exp Toxicol Pathol.,1999,51(6):489-90.

[9] Roper W, Wieczorek R. In vitro cytotoxicity of cigarette mainstream smoke. Evaluation of different cell exposure methods, including ‘native’ smoke aerosol exposure [C].2002 Coresta Congress, 2002.

[10] Eguchi K, Fukano Y, Suzuki M, et al. In vitro cytotoxicity of cigarette mainstream smoke with a whole smoke exposure system [C]. 2003 CORESTA Congress, 2003.

[11] Massey E D, Williamson J, Phillips J. 一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞在氣液界面上體外感受總煙氣的方法 [C]// 第56屆煙草科學(xué)研究會(huì)議論文集, 2003.

[12] Fukano Y, Suzuki m, Ogura m. 研制一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于卷煙煙氣中的體外暴露裝置 [C]//第56屆煙草科學(xué)研究會(huì)議論文集, 2003.

[13] Nishino T, Nara h, Fukano Y. Detection of cytotoxicity in the water-insoluble fraction of cigarette smoke gas vapor phase using a whole smoke exposure system [C]. 2007 Coresta Congress, 2007.

[14] Nishino T, Okuwa k, Fukano Y. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system [C].2008 Coresta Congress, 2008.

[15] Aufderheide M, Mohr U. The use of the modified Cultex?system for the direct exposure of bacteria to mainstream cigarette smoke [C]. 2004 Coresta Congress, 2004.

[16] Coresta in vitro toxicology task force. In vitro exposure of cells to smoke at the air liquid interface [EB/OL]. http:///www.CORESTA.org.

[17] Aufderheide M. An efficient approach to study the toxicological effects of complex mixtures [J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2008, 60(2-3):163-180.

[18] Cultex? Laboratories. http://www.cultex.com/ . 瀏覽時(shí)間：2011-4-9.

[19] Vitrocell Systems GmbH. http://www.vitrocell.com/ . 瀏覽時(shí)間：2011-4-9.

[20] Gaca M, Phillips J, Thorne d, et al. A new system for measuring the toxicity of mainstream cigarette smoke [C].2005 Coresta Congress, 2005.

[21] 盧斌斌, LynneWisse R M. 3 種不同焦油卷煙煙氣的細(xì)胞毒性比較 [J]. 煙草科技, 2007, 12: 38-41.

[22] Aufderheide M, Gressmann H. A modif i ed Ames assay reveals the mutagenicity of native cigarette mainstream smoke and its gas vapour phase [J]. Experimental and Toxicologic Pathology,2007, 58(6): 383-392.

[23] Ritter D J, Knebel JW, Aufderheide M. Comparative assessment of toxicities of mainstream smoke from commercial cigarettes [J]. Inhalation Toxicology, 2004, 16(10): 691-700.

[24] Olivera DS, Boggs SE, Beenhouwer C, et al. Cellular mechanisms of mainstream cigarette smoke-induced lung epithelial tight junction permeability changes in vitro [J].Inhalation Toxicology, 2007, 19(1): 13-22.

[25] Roller M, Aufderheide M. Statistical analysis of in vitro data for risk assessment - exemplified for a case of Ames test data [J].Experimental and Toxicologic Pathology, 2008, 60(2-3): 213-24.

[26] Richter A, Maunders H, Massey E D, et al. A toxicogenomic study of primary human lung epithelial cells exposed to whole cigarette smoke [C]. 2005 Coresta Congress, 2005.

[27] Adamson J, Azzopardi D, Dickens C J, et al. Generation and assessment of whole cigarette smoke to in vitro systems -British American Tobacco’s experience [C]. 2010 Coresta Congress, 2010.

[28] Wieczorek R, Roper W, Burghart H. Validation of a new smoking machine for the exposure of 96 well cell culture plates to‘native’ cigarette mainstream smoke aerosol. Course of action and some in vitro toxicological data [C]. 2005 Coresta Congress, 2005.

[29] Achard S, Blin N, Sevestre O, et al. Assessment of cigarette whole smoke biological activity [C]. 2006 Coresta Congress, 2006.

[30] Okuwa K, Tanaka M, Fukano Y, Nara H, et al. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens [J].Experimental and Toxicologic Pathology, 2010, 62(4): 433-440.

[31] Knebel JW, Ritter D, Aufderheide M. Exposure of human lung cells to native diesel motor exhaust— development of an optimized in vitro test strategy [J]. Toxicology in Vitro, 2002,16(2): 185-192.

[32] Aufderheide M, Gressmann H. Mutagenicity of native cigarette mainstream smoke and its gas/vapour phase by use of different tester strains and cigarettes in a modif i ed Ames assay[J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2008, 656(1-2): 82-87.

[33] Luo Y, Peter M, V, Xiaogang L, et al. Native polycystin 2 functions as a plasma membrane Ca2+-permeable cation channel in renal epithelia [J]. Molecular and Cellular Biology,2003, 23(7): 2600-2607.

[34] Adamson J, Kaur N, Lacasse M, et al. Characterisation of a cigarette smoking machine designed for air-liquid interface exposures: an inter- laboratory study [C]. 2011 Coresta joint meeting of the smoke science and product technology study groups, 2011.

[35] Aufderheide M, Ritter D, Knebel JW, et al. A method for in vitro analysis of the biological activity of complex mixtures such as sidestream cigarette smoke [J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2001, 53: 141-152.

[36] Aufderheide M, Knebel JW, Ritter D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke [J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2003, 55: 51-57.