利用微生物制劑提高梗絲品質(zhì)的研究

陳興，申曉峰，鞏效偉，陳微，黨立志，段焰青

紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明 650202

隨著我國卷煙工藝加工技術(shù)水平的提高和煙草行業(yè)減害降焦工作的持續(xù)開展，梗絲在卷煙配方中的應(yīng)用更加廣泛。在配方中加入梗絲后，由于其填充值較高，可以減少卷煙煙絲用量，不僅節(jié)約卷煙成本，也可以起到降低卷煙焦油量的作用[1-2]。然而，由于煙梗的主要成分是細(xì)胞壁物質(zhì)，包括大量的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素和果膠，其熱裂解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的刺激性和雜氣，且香氣貧乏，吃味平淡，嚴(yán)重影響卷煙的吸味品質(zhì)[3-4]，致使梗絲在卷煙配方中的摻兌比例一般不大，造成大量煙梗被廢棄。

微生物生長過程中，能夠通過直接或間接利用某些木質(zhì)素、纖維素、蛋白質(zhì)和微量元素等營養(yǎng)源，分解代謝合成出不同種類的生物酶，能夠有效促進(jìn)煙葉中大分子化合物之間的分解和轉(zhuǎn)化，促進(jìn)致香成分的產(chǎn)生和積累并降低有害成分的含量，從而提高煙葉的抽吸品質(zhì)[5-8]。利用微生物技術(shù)提高煙葉的香氣和品質(zhì)方面已有較多的研究。黃靜文等[9]將從烤煙葉面上分離到的短小芽孢桿菌用于煙絲發(fā)酵，處理后煙絲的化學(xué)成分比例更加協(xié)調(diào)，處理后的樣品煙香提高、煙氣更為醇和、刺激性和雜氣均有所改善；朱大恒等[10]利用產(chǎn)香菌的發(fā)酵產(chǎn)物作為香料來提高煙葉香氣，使卷煙品質(zhì)明顯改善。然而，利用微生物直接作用于梗絲，提高梗絲抽吸品質(zhì)的報(bào)道尚不多見[11]。本研究利用產(chǎn)香微生物制劑作用于梗絲，旨在探討利用微生物制劑提高梗絲抽吸品質(zhì)的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 梗絲材料

云南烤煙煙梗，紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司昆明卷煙廠梗加工車間切絲。

1.1.2 菌種

實(shí)驗(yàn)室保存的短小芽孢桿菌V35菌株（Bacillus pumilusVan35），分離至醇化煙葉表面。該菌株目前已保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 3411。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，加水至1 L。121℃滅菌20 min，用于菌種培養(yǎng)。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

Skalar SANPWS 流動分析儀（荷蘭Skalar公司）；ABS204-S 電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler Toledo公司）；Cyclotec 1093 旋風(fēng)式樣品磨（瑞典FOSS中國有限公司）；FED可編程熱風(fēng)循環(huán)烘箱（德國Binder公司）；R114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BüCHI公司）；6890N/5975N 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，使用HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（美國Agilent 公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)和微生物制劑的制備

將菌株V35接種于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，獲得液體菌種。將液體菌種按0.1 %的接種量接種于200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)14 h至OD值為2.0。取培養(yǎng)液20 mL，以8000 r/min離心10 min，去上清。用無菌水洗滌沉淀，離心。最后用200 mL無菌水振蕩均勻，即為微生物制劑。

1.2.2 梗絲的處理

分別取菌劑5 mL，10 mL，20 mL，不足20 mL則用無菌水補(bǔ)足至20 mL，振蕩均勻，即得不同濃度處理液。用小型噴霧器分別將處理液均勻地噴加到100g梗絲上；以噴加無菌水為對照，設(shè)置3次重復(fù)。將梗絲裝入密封袋，并在袋上扎少量小孔。30℃處理48 h后，將溫度升至120℃保持20 min，使菌在高溫下失活。將梗絲于120℃烘箱中烘干，使水分含量達(dá)到11%-13%。

1.2.3 化學(xué)成分的測定

按行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法（YC/T159-2002，YC/T160-2002，YC/T161-2002，YC/T 162-2002，YC/T 217-2007）測定樣品中可溶性總糖、還原糖、總煙堿、總氮、氯、鉀的含量。

1.2.4 細(xì)胞壁成分的測定

細(xì)胞壁成分的測定方法參照張槐苓等[12]。

1.2.5 致香成分的測定

用GC-MS檢測樣品中致香成分的含量。GC-MS分析測試條件：毛細(xì)管柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 m）；進(jìn)樣口溫度：240℃；載氣：He，1 mL/min；程序升溫：初始溫度50℃，保持1 min，以8℃/min升溫到160℃，保持2 min，再以8℃/min升溫到260℃，保持15 min；進(jìn)樣量：2 μL，分流比：25:1；傳輸線溫度：280℃；電離方式：EI，電離能量：70eV；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：160℃；質(zhì)量范圍35-455 amu。按此分析測試條件，對揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，所得圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫（NIST98，Wiley275）檢索，并用內(nèi)標(biāo)校正歸一化法計(jì)算各峰的相對含量。

1.2.6 感官評價(jià)

將處理后的梗絲及對照放入恒溫恒濕箱中，在溫度（22±1）℃、相對濕度（60±2）%平衡48 h，手工卷制成卷煙，由評吸專家組成的評吸小組進(jìn)行感官評吸。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 V35菌劑處理后梗絲化學(xué)成分的變化

按10 mL菌劑/100 g梗絲處理48 h后，對梗絲的化學(xué)成分進(jìn)行了檢測并經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表1。經(jīng)菌劑處理后，梗絲的多項(xiàng)化學(xué)成分發(fā)生了顯著的變化。經(jīng)V35菌劑處理后，梗絲的總糖和還原糖含量分別較對照上升了10.19 %、10.68 %，達(dá)極顯著水平；總氮含量較對照下降了5.70 %，達(dá)顯著水平；氯離子、鉀離子及總煙堿變化不明顯。V35菌劑處理后，梗絲的糖氮比和糖堿比分別較對照升高了17.70 %和 8.00 %。

表1 V35菌劑處理對梗絲化學(xué)成分含量的影響

2.2 V35菌劑處理對梗絲細(xì)胞壁成分的影響

按10 mL菌劑/100 g梗絲處理48 h后，對梗絲的化學(xué)成分進(jìn)行了檢測并經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表2。經(jīng)菌劑處理后，梗絲的纖維素和果膠含量顯著降低，分別較對照下降9.78%、8.06%，總細(xì)胞壁物質(zhì)含量下降6.02%。經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行方差分析可知，纖維素含量及細(xì)胞壁物質(zhì)總量與對照相比差異達(dá)顯著水平，果膠含量與對照達(dá)極顯著水平，說明V35處理對于降低煙梗中纖維素、果膠及總細(xì)胞壁物質(zhì)含量效果明顯，而對半纖維素和木質(zhì)素的含量影響不顯著。

表2 V35菌劑對梗絲細(xì)胞壁成分含量的影響

2.3 V35菌劑處理后梗絲致香成分的變化

按10 mL菌劑/100 g梗絲處理48 h后，通過GC-MS對樣品的致香成分的含量和變化進(jìn)行了檢測。煙葉中主要的香氣物質(zhì)有類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、苯丙氨酸代謝產(chǎn)物、萜烯類化合物、非酶棕色化反應(yīng)產(chǎn)物幾大類[12]。對V35菌劑處理后的香氣成分進(jìn)行了分析，結(jié)果如表3所示。

類胡蘿卜素是煙葉中重要的香氣前體物，煙葉經(jīng)調(diào)制、醇化后95%的類胡蘿卜素將分解形成不同的香味物質(zhì)，對煙葉的香氣起著重要的作用[13]。從表3中可以看出，V35菌劑處理后煙梗的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量較對照有所升高，升高幅度為17.95%。煙草中苯丙氨酸的代謝轉(zhuǎn)化是影響煙草香味的重要過程之一，其代謝產(chǎn)物如苯甲醇、苯乙醇都是煙草中的重要致香成分，可使煙草增加類似花香的香味[12]。V35菌劑處理后，梗絲的苯甲醛、苯甲醇、苯乙醇和苯乙醛均表現(xiàn)出一定的增加，苯丙氨酸類物質(zhì)總量較對照也有所增加。V35菌劑處理后新植二烯的含量有所升高，萜烯類物質(zhì)總量也表現(xiàn)為一定程度的升高。糖類和氨基酸的非酶棕色化反應(yīng)所生成的雜環(huán)產(chǎn)物是煙草香氣的重要來源之一[14]。V35處理后非酶棕色化反應(yīng)產(chǎn)物較對照有所增加。用V35菌劑對梗絲進(jìn)行處理后，香氣物質(zhì)總量增加幅度達(dá)到了14.65 %，說明利用微生物菌劑處理有利于增加煙?？倱]發(fā)性香氣物質(zhì)的含量。

表3 V35菌劑處理后梗絲致香成分檢測結(jié)果 （μg/g)

2.4 V35菌劑處理后梗絲感官評吸結(jié)果

表4 V35菌劑處理對梗絲抽吸品質(zhì)的影響

對不同濃度V35菌劑處理后的梗絲進(jìn)行感官評吸，評吸結(jié)果見表4。評吸結(jié)果表明，經(jīng)V35處理的梗絲香氣特征表現(xiàn)更為突出，煙氣刺激性有所改善，評吸排序表明適宜的處理濃度為10 mL菌液/100 g梗絲。

3 討論

微生物在生長過程中產(chǎn)生生物酶，生物酶能夠改變反應(yīng)底物分子的形狀和催化加速底物分子內(nèi)部某些化學(xué)鏈的斷裂，加速底物大分子的降解和某些有害物質(zhì)的分解，并通過特定微生物的吸收、利用、轉(zhuǎn)化形成一系列有益小分子化合物[15]。于建軍等[16]利用果膠酶處理煙葉，結(jié)果表明果膠酶能夠降低煙葉中果膠含量，而總糖含量則隨之升高，利用果膠酶將煙葉中的果膠轉(zhuǎn)化為水溶性糖是提高煙葉質(zhì)量的有效手段之一。V35處理后，梗絲的總糖和還原糖含量升高，而纖維素和果膠含量有所下降，其原因推測是由于V35菌株在生長過程中產(chǎn)生的一系列酶類具有降解纖維素、果膠等大分子物質(zhì)為水溶性糖類的作用。微生物對梗絲品質(zhì)的提升作用是多種因素綜合作用的結(jié)果，其機(jī)理仍需進(jìn)一步的深入研究。

4 結(jié)論

利用微生物菌株V35制成菌劑用于梗絲處理，與對照相比，處理后梗絲纖維素、果膠及細(xì)胞壁物質(zhì)總量有所降低，總糖和還原糖有所上升，總氮含量下降；同時(shí)四大類致香成分均有所提升。感官評吸表明，梗絲香氣量有所提升，雜氣和刺激性降低。但該結(jié)果是在實(shí)驗(yàn)室條件下取得的，其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

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