固相萃取–液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定水中的喹諾酮類和磺胺類抗生素*

尹燕敏，沈穎青，顧海東，秦宏兵

（1.蘇州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，江蘇蘇州 215004； 2.江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，南京 210036）

喹 諾 酮 類（quinolones，QNs）和 磺 胺 類（sulifonamides，SAs）藥物為廣譜抑菌藥，因其具有抗菌譜廣、高效、低毒、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖生產(chǎn)中廣泛使用［1］。喹諾酮類抗生素大量用于人類和動(dòng)物醫(yī)療，還添加于飼料中以提高飼料利用率和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)?；前奉愃幬镉糜陬A(yù)防和治療細(xì)菌性感染疾?。?］，但過(guò)量使用有可能在人體內(nèi)蓄積，蓄積濃度超過(guò)一定值時(shí)對(duì)人體有害，并導(dǎo)致病原體產(chǎn)生耐藥性［3］。與其它常用抗生素相比，這些藥物性質(zhì)更加穩(wěn)定，但其在動(dòng)物源性食品中的殘留可通過(guò)食物鏈對(duì)人體健康構(gòu)成危害［1］。

抗生素?cái)z入后大部分以原藥和代謝產(chǎn)物的形式隨糞尿排出體外，成為新的環(huán)境污染物，并以多種途徑進(jìn)入河水、地表水甚至飲用水及土壤中［4］。有調(diào)查表明，磺胺藥物在人體中長(zhǎng)期存在會(huì)導(dǎo)致許多細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，且有潛在的致癌性，已被多個(gè)國(guó)家規(guī)定限量或禁止使用；而喹諾酮類藥物在美國(guó)屬水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的禁用藥［5］。

QNs和SAs藥物及其代謝物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）和高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC–MS／MS）［6–10］。HPLC的靈敏度較低且無(wú)法提供結(jié)構(gòu)信息，一般作為篩選方法；HPLC–MS／MS靈敏度高，選擇性和特異性好，抗干擾能力強(qiáng)，能夠?qū)δ繕?biāo)化合物含量較低的樣品進(jìn)行很好的定性確認(rèn)，是目前較為先進(jìn)和常用的動(dòng)物源性食品中藥物殘留檢測(cè)方法。液質(zhì)聯(lián)用法由于其較高的靈敏度被廣泛應(yīng)用于環(huán)境中抗生素類藥物的檢測(cè)［8–10］。

筆者采用了固相萃取–超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定了環(huán)丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、恩諾沙星（ENR）、洛美沙星（LOM）、諾氟沙星（NOR）5種喹諾酮類和磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺-5-甲氧基嘧啶（SM）、磺胺-2-甲基嘧啶（SMZ）、磺胺甲基異噁唑（SMX）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（SD）、磺胺二甲氧嗪（SDX）6種磺胺類抗生素，優(yōu)化了前處理?xiàng)l件和分離檢測(cè)條件，并應(yīng)用于實(shí)際水樣的分析，該方法具有操作簡(jiǎn)單、試劑少、分離速度快、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters Acquity UPLC／Xevo TQMS型，美國(guó)Waters公司；

全自動(dòng)固相萃取儀：6位Autotrace SPE，美國(guó)Caliper公司；

氮吹儀：MG–2200型，日本EYELA公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國(guó)Merck公司；

甲酸：色譜純，美國(guó)Tedia公司；

氫氧化鈉：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

環(huán)丙沙星（純度大于94.0%）、氧氟沙星（純度大于99.0%）、恩諾沙星（純度大于99.0%）、洛美沙星（純度大于97.6%）、諾氟沙星（純度大于99.0%）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

磺胺嘧啶、磺胺-5-甲氧基嘧啶、磺胺-2-甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度大于99%，美國(guó)Sigamaldrich公司。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：UPLC BEH C18（50 mm×21 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A為0.01%（體積分?jǐn)?shù)）的甲酸溶液，B為甲醇，梯度洗脫條件見表1，流速為0.4 mL／min。

表1 目標(biāo)化合物的梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用正離子電噴霧離子源（ESI+），霧化氣、脫溶劑氣、錐孔氣為氮?dú)?，碰撞氣為氬氣；源溫度和脫溶劑氣溫度分別為150℃和500℃；脫溶劑流速和錐孔氣流速分別為800 L／h和50 L／h；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；檢測(cè)方式為MRM模式。

1.3 樣品處理

固相萃?。篧aters Oasis HLB固相萃取小柱依次用6 mL甲醇活化2次、6 mL水、6 mL甲酸溶液（pH 3）進(jìn)行活化。水樣經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后取500 mL水樣，調(diào)pH后過(guò)小柱，富集完成后用10 mL水淋洗，氮吹20 min，用12 mL洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液氮吹至近干后用初始流動(dòng)相定容至1 mL，過(guò)0.2 μm膜進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化使分離效果最好和檢測(cè)時(shí)間最短，同時(shí)選擇有利于離子化的流動(dòng)相以使質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度最高。喹諾酮類藥物是兩性化合物，磺胺類藥物在結(jié)構(gòu)中也含有—NH2，易與色譜填料中的殘余硅羥基產(chǎn)生氫鍵，造成峰形拖尾、展寬，保留時(shí)間漂移等現(xiàn)象，成為色譜條件優(yōu)化的難點(diǎn)。

一般反相色譜的流動(dòng)相均采用甲醇、乙腈及一定濃度的緩沖鹽，而在液質(zhì)聯(lián)用法中加入一定濃度的甲酸有利于形成［M+H］+。實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為流動(dòng)相，同時(shí)考察了在流動(dòng)相中添加不同濃度的甲酸對(duì)色譜分離和質(zhì)譜靈敏度的影響，發(fā)現(xiàn)在不加甲酸的條件下，喹諾酮類很難洗脫，優(yōu)化甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.01%，0.05%，0.1%，0.2%發(fā)現(xiàn)隨著甲酸含量的增加，目標(biāo)化合物的響應(yīng)率有所下降，在甲酸濃度為0.2%時(shí)，SM和SMZ無(wú)法分離，所以本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相選擇為甲醇和0.01%的甲酸水溶液。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行痕量分析。首先，利用Infusion連續(xù)進(jìn)樣，在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結(jié)果表明，在正離子模式下，這些化合物全掃描的分子離子［M+H］+最理想。因此選用目標(biāo)化合物的［M+H］+做碰撞誘導(dǎo)解離的母離子。在MS／MS模式下，通過(guò)Infusion方式將1 mg／L的目標(biāo)化合物直接引入三重四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，調(diào)整碰撞能量找到母離子對(duì)應(yīng)的子離子，并利用Masslynx軟件Intellistart功能自動(dòng)選擇子離子和優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)。在確定了待測(cè)化合物監(jiān)測(cè)的母離子和子離子的基礎(chǔ)上，對(duì)各種待測(cè)化合物的毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件

2.3 固相萃取條件優(yōu)化

影響固相萃取富集效率的因素有固相萃取小柱類型、樣品pH、上樣速度等，采用空白加標(biāo)對(duì)上述因素進(jìn)行優(yōu)化。分別采用C18固相萃取小柱和Waters Oasis HLB小柱對(duì)水樣進(jìn)行富集，發(fā)現(xiàn)采用HLB小柱時(shí)目標(biāo)化合物的空白加標(biāo)回收率為86.7%～118%，而采用C18小柱時(shí)目標(biāo)化合物的空白加標(biāo)回收率為55.3%～84.6%，HLB小柱回收率顯著高于C18小柱，所以選用HLB小柱。比較了樣品pH值為3和7的空白加標(biāo)水樣的提取效率。發(fā)現(xiàn)在pH值為3時(shí)，目標(biāo)化合物的空白加標(biāo)回收率為84.7%～114%，pH值為7時(shí)，目標(biāo)化合物的空白加標(biāo)回收率為66.4%～92.3%，因此調(diào)節(jié)水樣pH值為3。

上樣流速分別為5，10 mL／min時(shí)，空白加標(biāo)的回收率沒(méi)有顯著差異，選擇上樣速率為10 mL／min。

2.4 方法線性范圍、檢出限

將抗生素儲(chǔ)備液（100 mg／L）用初始流動(dòng)相稀釋至標(biāo)準(zhǔn)溶液系列（喹諾酮類0.5～50 μg／L，磺胺類1～100 μg／L），按照1.2儀器條件進(jìn)行分析。以定量離子對(duì)的響應(yīng)面積（Y）和對(duì)應(yīng)濃度（X，μg／L）進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。以2～5倍基線噪音響應(yīng)對(duì)應(yīng)的濃度進(jìn)行空白加標(biāo)，以3倍信噪比（S／N）估算方法檢出限，11種目標(biāo)化合物的方法檢出限在0.04～0.24 ng／L之間，其線性方程、相關(guān)系數(shù)r、檢出限等見表3。色譜圖見圖1（喹諾酮類5 μg／L，磺胺類10 μg／L）。

圖1 11種目標(biāo)化合物的總離子流

表3 目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限

2.5 精密度試驗(yàn)

以5 μg／L的QNs和10 μg／L的SAs重復(fù)進(jìn)樣6次驗(yàn)證儀器精密度，6次進(jìn)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為QNs 1.7%～6.4%，SAs 2.2%～5.9%。取100 ng／L目標(biāo)化合物進(jìn)行空白加標(biāo)回收試驗(yàn)，6次空白加標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為QNs 5.3%～9.0%，SAs 4.7%～10.2%。

2.6 實(shí)際水樣分析與回收試驗(yàn)

在空白水樣中分別添加10 ng／L和100 ng／L目標(biāo)化合物進(jìn)行空白加標(biāo)回收試驗(yàn)，采用外標(biāo)法定量。為了考察不同類型的水體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，筆者進(jìn)行了地表水樣的加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示11種目標(biāo)化合物在實(shí)際水樣中的加標(biāo)回收率為62.1%～137%，結(jié)果見表4。

表4 實(shí)際水樣的加標(biāo)回收結(jié)果

3 結(jié)論

建立了水中喹諾酮和磺胺類抗生素的超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。該方法可在8 min內(nèi)完成對(duì)11種目標(biāo)化合物的分析，方法檢出限為0.04～0.24 ng／L，外標(biāo)法定量準(zhǔn)確性較好。地表水測(cè)定結(jié)果表明地表水中已經(jīng)受到抗生素污染，尤其是磺胺甲基異噁唑的污染，情況應(yīng)該引起重視。該法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、綠色環(huán)保的特點(diǎn)，適合環(huán)保行業(yè)對(duì)喹諾酮及磺胺類抗生素的檢測(cè)。

［1］ 厲文輝，史亞利，高立紅，等.加速溶劑萃取–高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)魚肉中喹諾酮、磺胺與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29(10): 987–992.

［2］ 陳瑩，陳輝，林谷園，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)鰻魚中大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留量的同時(shí)測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27(5): 538–541.

［3］ 李鋒格，蘇敏，李曉巖，等.分散固相萃取–超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肝中磺胺類、喹諾酮類和苯并咪唑類藥物及其代謝物的殘留量［J］.色譜，2011，29(2): 120–125.

［4］ 馬麗麗，郭昌勝，胡偉，等.固相萃取–高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定土壤中氟喹諾酮、四環(huán)素和磺胺類抗生素［J］.分析化學(xué)，2010，38(1): 21–26.

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