液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定生鮮乳中氯噻嗪殘留量

田素潤，蔣俊樹，丁磊

(安徽國家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化與監(jiān)測中心，合肥 230051)

利尿劑通常在一些病理狀況下用作治療藥物以排出體內(nèi)流體，其不僅能促使腎臟排泄水和鹽，同時也影響腎臟吸收和排泄其它離子如鉀、鈣、鎂等。由于其作用迅速、強(qiáng)大而短暫，被廣泛地用于畜禽養(yǎng)殖中治療嚴(yán)重心、肝、腎性各類水腫，預(yù)防急性腎功能衰竭和加速毒物排出。若飼養(yǎng)者未經(jīng)授權(quán)使用或者未遵循使用說明使用，可能導(dǎo)致其通過肉、奶進(jìn)入消費者體內(nèi)，危害消費者身體健康。長期食用含有利尿劑殘留的食物可能使尿中的鹽和電解質(zhì)過度流失，破壞體內(nèi)電解質(zhì)平衡，嚴(yán)重時還會導(dǎo)致心律不齊或心臟衰竭而危及生命。因此有必要監(jiān)控利尿劑在禽肉和奶中的殘留，以免消費者身體健康遭受危害。作為被批準(zhǔn)用作奶牛養(yǎng)殖中治療奶牛乳腺及相關(guān)水腫的4種利尿劑之一，氯噻嗪不僅具有利尿作用，而且還具有降壓作用。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定乳牛使用氯噻嗪的休藥期為72 h，但目前還沒有規(guī)定氯噻嗪的容許量，F(xiàn)DA只有一個臨時性的安全水平限，規(guī)定氯噻嗪在牛奶中的限量為67 μg／kg。

目前，利尿劑殘留的檢測主要面向飼料、人及動物尿液、保健食品等，方法有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜–質(zhì)譜法、液相色譜–質(zhì)譜法［1–9］。液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法以其高靈敏度和可靠的確證性能，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。生鮮乳樣品含有大量的脂肪和蛋白，基質(zhì)較為復(fù)雜，特別是前處理過程與一般樣品差異較大。筆者采用液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定生鮮乳中氯噻嗪殘留量，為養(yǎng)殖環(huán)節(jié)利尿劑藥物的監(jiān)控及生鮮乳質(zhì)量安全提供了技術(shù)保障。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：6490 Triple Quad LC–MS／MS型，美國安捷倫公司；

去離子水發(fā)生器：Milli–Q型，美國Millipore公司；

離心機(jī)：HERMLE Z–323K型，德國Hermle Labortechnik公司；

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸：色譜純，美國Tedia公司；

乙酸鉛、鎢酸鈉：分析純，上海國藥化學(xué)試有限公司；

有機(jī)微孔過濾膜：孔徑為0.22 μm；

氯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.0%，美國Sigma公司；

氯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備液：100 μg／mL，用甲醇配制，于冰箱中–20℃保存。根據(jù)需要用流動相將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成適合濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；

實驗用水為Milli-Q去離子高純水。

1.2 樣品前處理

取5 mL生鮮乳樣品至15 mL離心管中，在4℃以2 000 r／min轉(zhuǎn)速離心10 min，去除上層脂肪。脫脂后的樣品轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈和2 mL 5%乙酸鉛溶液渦旋混合沉淀蛋白，在4℃以5 000 r／min離心10 min。取上清液至50 mL離心管中，加入25 mL水飽和的乙酸乙酯，渦旋混合，離心分層，有機(jī)相中加入5 mL 10%鎢酸鈉溶液，渦旋混合，離心分層，有機(jī)相在40℃下氮吹至近干，用流動相定容后過有機(jī)微孔濾膜，濾液供LC–MS／MS測定。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ZOBRAX SB–C18型（50 mm×2.1 mm， 1.8 μm）；流動相：乙腈– 0.1%甲酸溶液（體積比為30∶70），流速為200 μL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10 L／min；霧化器壓力：2.76×105Pa（40 psi）；毛細(xì)管電壓：4 000 V。

最佳的碰撞電壓及定性離子對、定量離子對、保留時間及碰撞能量見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取、凈化條件

生鮮乳中主要含脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸和碳水化合物等，成分復(fù)雜，前處理過程與一般樣品差異較大。在進(jìn)樣前需要進(jìn)行必要的凈化處理，否則會干擾電噴霧過程的離子化程度，形成基質(zhì)效應(yīng)，從而影響測定結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性。

筆者在參考相關(guān)文獻(xiàn)［1–9］的基礎(chǔ)上，先在4℃下冷凍離心去除上層脂肪，再加入10 mL乙腈和2 mL 5%乙酸鉛溶液作為蛋白沉淀劑。選擇乙酸乙酯作為提取劑，有機(jī)相在40℃下用氮氣吹至近干，用流動相定容，過有機(jī)微孔濾膜后供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

以乙酸乙酯為提取劑進(jìn)行冷凍離心，能較好地提取氯噻嗪，并去除干擾組分的影響。以空白樣品提取液做質(zhì)譜全掃描，未發(fā)現(xiàn)有較大的基質(zhì)干擾峰，說明本方法無明顯基質(zhì)干擾，分析準(zhǔn)確度高。

2.2 色譜、質(zhì)譜分析條件

由于氯噻嗪中含有多個極性基團(tuán)，在一些色譜柱中會出現(xiàn)保留時間無規(guī)則的漂移。為了得到相對比較穩(wěn)定的色譜保留時間，考察了Agilent ZOBRAX SB–C18色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯噻嗪色譜峰形良好。另外，當(dāng)流動相中添加0.1%的甲酸溶液時，氯噻嗪色譜峰形能得到進(jìn)一步改善，離子化效率較高。對流動相流速進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流速為0.2 mL／min時離子化效率最高。

液相色譜以0.2 mL／min的流速將20.0 μg／L的氯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液引入離子源，分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行工作，發(fā)現(xiàn)該化合物適合負(fù)離子模式，這是因為該化合物中含有羧基，更易于失去H+。在ES–條件下一級質(zhì)譜分析得到［M–H］+分子離子峰，即選取m／z 294.1為分子離子。再以20.0 μg／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，以獲得最佳的質(zhì)譜條件。分別在120，130，140，150 eV的碰撞電壓下對氯噻嗪的分子離子進(jìn)行選擇性監(jiān)測，比較不同碰撞電壓下分子離子的強(qiáng)度，確定氯噻嗪的最佳解離電壓為140 eV。在140 eV的碰撞電壓下，對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，比較不同碰撞能量對特征離子的影響，使特征離子強(qiáng)度達(dá)到最大，最終確定m／z 179為定性離子，m／z 214為定量離子，優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測條件見表1。

在最佳實驗條件下，氯噻嗪的總離子流色譜圖、二級質(zhì)譜圖、空白樣品總離子流圖分別見圖1～圖3。

圖1 氯噻嗪總離子色譜圖

圖2 氯噻嗪二級質(zhì)譜圖

圖3 空白樣品總離子色譜圖

2.3 方法的線性范圍與定量限

在優(yōu)化的測定條件下，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。以目標(biāo)物定量離子的峰面積(Y)對氯噻嗪濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在5 ～100 μg／L范圍內(nèi)，氯噻嗪的質(zhì)量濃度和定量離子的峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999，線性方程為Y=42 394X–34 647，氯噻嗪的定量限（S／N=10）為5 μg／L。

2.4 方法的精密度與回收率

在生鮮乳陰性樣品中加入適當(dāng)濃度的氯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)量相當(dāng)于10，50，100 μg／kg，渦旋混合。每個添加水平按1.2和1.3的方法重復(fù)測定6次。實驗測得方法的回收率為86%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.8%～7.5%。方法的測量精密度和加標(biāo)回收率見表2。

表2 氯噻嗪的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

用液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定生鮮乳中氯噻嗪殘留量，對凈化方法、色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，該方法具有操作簡便，定性、定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好和靈敏度高的特點。能滿足生鮮乳中氯噻嗪殘留量的檢測要求，填補(bǔ)了國內(nèi)檢測方法空白，為今后制定相關(guān)檢驗標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。

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