多齒紅山茶籽多酚組分的抗氧活性研究

王進英 鐘海雁 朱曉陽 周 波

（1．稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004；2．糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004；3．中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

油茶（Camellia oleifera）是中國特有的食用油料樹種之一。

關(guān)于油茶多酚提取的研究報告較多，包括溶劑提取方法［1］，乙醇提取和超聲波輔助提取結(jié)合正交試驗設(shè)計方法，BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析方法相結(jié)合進行仿真模擬和優(yōu)化對油茶籽餅多酚進行提?。?，3］以及響應面法對微波輔助提取［3－5］等。袁英姿等［4，6］分別研究了大孔吸附樹脂純化油茶籽多酚的方法和油茶籽多酚的抗氧化性，通過靜態(tài)吸附與解吸試驗，從5種樹脂中篩選出D－3520為純化油茶籽多酚理想的吸附樹脂；抗氧化性研究表明單甘酯能將油茶籽多酚－茶油乳化分散成均勻的體系，有助于提高油茶籽多酚的抗氧化性，尤其是油茶籽多酚與抗壞血酸協(xié)同使用時，抗氧化效果優(yōu)于BHT。毛方華等［7］研究表明，油茶籽毛油中的多酚類物質(zhì)對羥基自由基及超氧陰離子自由基有良好的清除作用，加入多酚樣品的濃度為0．53～7．29μg／mL 時，對羥基自由基的清除率達65．21%以上。陳虹霞等［8］從茶籽餅粕中提取黃酮苷類化合物，通過高效液相色譜制備收集并通過IR、MS和NMR 進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明兩種化合物分別為山奈酚3－O－［2－O－β－D－半乳糖－6－O－α－L－鼠李糖］－β－D－葡萄糖苷和山奈酚3－O－［2－O－β－D－木糖－6－O－α－L－鼠李糖］－β－D－葡萄糖苷。

Takashi Yoshida等［9］從油茶中分離出1種新的二聚體鞣花單寧Camellioferin A 及13種已知的單寧類物質(zhì)，包括Camellins A 和B，并通過光譜法對新物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行了鑒定。Daisuke Mukai等［10，11］從油茶葉中分離出5種新的單寧類物質(zhì)，以驅(qū)蟲藥甲苯咪唑為陽性對照研究了它們對秀麗隱桿線蟲的毒性，結(jié)果表明其中3種物質(zhì)的LC50值小于甲苯咪唑，因此很多油茶多酚類物質(zhì)可能具有殺蟲作用。

如上所述，國內(nèi)外工作者對油茶多酚的提取、純化及功能活性作用等已進行了某些方面的研究，但相關(guān)報道總體還不是太多，特別是中國國內(nèi)對油茶多酚結(jié)構(gòu)鑒定與生物學活性及其機理研究方面還有待深入。

本試驗以多齒紅山茶茶籽為研究對象，采用DPPH 法和ABTS法對半制備色譜分離出的多齒紅山茶茶籽多酚類物質(zhì)進行測定，評價其體外抗氧化能力，以期為油茶多酚物質(zhì)的利用提供一定的理論支持和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料及處理

多齒紅山茶（Camellia polyodonta how）：山茶科山茶屬，茶籽采于長沙市中南林科大校園。油茶籽多酚的提?。簩⒂筒枳讶ぃQ取40g，研磨，采用600 mL 60%的甲醇作為溶劑，在功率為800 W 的微波爐中提取60s，過400目篩后，400r／min離心10min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑。

1．2 試劑與儀器設(shè)備

DPPH·、ABTS＋、L－抗壞血酸（VC）、生育酚：美國Sigma公司；

過硫酸鉀（K2S2O8）：99%，天津市大茂化學試劑廠；

甲醇、無水乙醇：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

紫外分光光度計：UV－1800型，日本島津公司；

超低溫冰箱：DW－86L628型，海爾公司。

1．3 試驗方法

1．3．1 樣品清除DPPH·自由基能力的測定 用甲醇溶解DPPH·粉末，配制成6mmol／L 的儲備液，－20 ℃保存，臨用前用甲醇稀釋至60μmol／L。根據(jù)清除DPPH·自由基預試驗的結(jié)果，為了使測定的吸光度在合適的范圍內(nèi)，L－抗壞血酸 配 制 成 濃 度 為113．56～681．35 μmol／L，即20～120μg／mL的水溶液，將分離得到的10種組分樣品用50%乙醇水溶液分別配制成濃度為20～8 000μg／mL 的溶液，取0．4mL樣品或L－抗壞血酸溶液和2．4 mL DPPH·溶液在室溫下混合均勻，置于暗處反應30min，在515nm 波長下讀取吸光度。L－抗壞血酸用作陽性對照，同時設(shè)空白陰性對照。清除活性用半數(shù)有效濃度（EC50）表示。依據(jù)式（1）計算清除率。

式中：

R—— 清除率，%；

A空白—— 空白對照的吸光度；

A樣品—— 加入樣品反應后的吸光度。

1．3．2 樣品清除ABTS·＋自由基能力的測定 將5 mL 7mmol／L 的ABTS·＋水溶液和88μL 140mmol／L的高硫酸鉀混合，在室溫下避光還原12～16h后，得到ABTS·＋自由基儲備液。該儲備液在室溫、避光的條件下穩(wěn)定。

ABTS·＋儲備液在使用前用無水乙醇稀釋，直至在分光光度計上于734nm 波長處測定到吸光度為0．51±0．02。根據(jù)清除ABTS·＋自由基預試驗的結(jié)果，為了使測定的吸光度在合適的范圍內(nèi)，生育酚用50%乙醇水溶液配制成濃度為20～120μmol／L，即5～30μg／mL的溶液，樣品分別用同樣的乙醇水溶液配制成濃度為2．5～6 000μg／mL 的溶液，取0．4mL樣品或生育酚溶液和2．4mL ABTS·＋溶液在室溫下混合10s，置于暗處6 min，在734nm 波長下讀取吸光度。生育酚用作陽性對照，同時設(shè)空白陰性對照。清除活性用半數(shù)有效濃度（EC50）表示。依據(jù)式（1）計算清除率。

2 結(jié)果與分析

2．1 各組分清除DPPH·自由基的能力

由表1可知，10種組分的濃度均與DPPH·自由基清除能力成正比例變化，相關(guān)系數(shù)R2在0．858 7～0．994 6，說明組分濃度和DPPH·自由基清除能力具有良好的量效關(guān)系。10種組分和L－抗壞血酸的DPPH·自由基清除能力大小為L－抗壞血酸＞組分2＞組分3＞組分8＞組分5＞組分9＞組分1＞組分4＞組分6＞組分7＞組分10。10 種組分的DPPH·自由基清除能力均低于L－抗壞血酸。

表1 L－抗壞血酸和10種組分的線性回歸方程與半數(shù)有效濃度（EC50）Table1 Linear regression equation and EC50of Vitamin C and 10fractions

2．2 組分清除ABTS·＋ 自由基的能力

由表2可知，10種組分的濃度均與ABTS·＋自由基清除能力成正比例變化，相關(guān)系數(shù)R2在0．839 8～0．996 8，結(jié)果說明組分濃度和ABTS·＋自由基清除能力具有良好的量效關(guān)系。10種組分和生育酚的ABTS·＋自由基清除能力大小為組分3＞生育酚＞組分2＞組分8＞組分5＞組分4＞組分1＞組分9＞組分6＞組分7＞組分10。組分3 對ABTS·＋自由基的清除能力強于生育酚，其它9 種組分的清除能力低于生育酚。

表2 生育酚和10種組分的線性回歸方程與半數(shù)有效濃度（EC50）Table2 Linear regression equation and EC50of Trolox and 10fractions

3 結(jié)論

本試驗主要通過DPPH 法和ABTS法這兩種體外抗氧化能力的評價方法研究了半制備色譜分離收集的多齒紅山茶茶籽多酚類物質(zhì)的抗氧化活性。

在試驗濃度范圍內(nèi)，10種組分的濃度與DPPH·自由基和ABTS·＋自由基清除能力成正比例變化，曲線的相關(guān)系數(shù)R2均在0．858 7～0．994 6，組分濃度與DPPH·自由基和ABTS·＋自由基的清除能力具有良好的量效關(guān)系。10種組分和L－抗壞血酸的DPPH·自由基清除能力大小為L－抗壞血酸＞組分2＞組分3＞組分8＞組分5＞組分9＞組分1＞組分4＞組分6＞組分7＞組分10。10種組分的DPPH·自由基清除能力均低于L－抗壞血酸。10 種組分和生育酚的ABTS·＋自由基清除能力大小為組分3＞生育酚＞組分2＞組分8＞組分5＞組分4＞組分1＞組分9＞組分6＞組分7＞組分10。組分3對ABTS·＋自由基的清除能力強于生育酚，其它9種組分的清除能力低于生育酚。

體外抗氧化能力的測定結(jié)果并不是很理想，多數(shù)組分的抗氧化能力低于標準樣品，有一部分組分的抗氧化能力與標準樣品接近，只有組分3的ABTS·＋自由基清除能力明顯強于生育酚。但由于使用的試驗方法只有兩種，結(jié)果并不全面，有待今后使用更多的抗氧化能力評價方法對茶籽多酚進行研究。

1 曾獻，袁英姿，曹清明，等．油茶籽多酚的提取研究［J］．食品與機械，2008，24（4）：69～72．

2 王徐卿，沈建福，王敏，等．油茶籽餅多酚的乙醇提取工藝優(yōu)化研究［J］．浙江林業(yè)科技，2007，27（3）：41～44．

3 王徐卿，沈建福，王敏，等．超聲波輔助提取油茶籽餅多酚類物質(zhì)工藝的研究［J］．食品科技，2007（9）：238～241．

4 呂杰，鐘海雁，袁英姿，等．油茶籽多酚微波輔助提取響應面法的優(yōu)化［J］．經(jīng)濟林研究，2010，28（3）：40～44．

5 袁英姿，曹清明，鐘海雁，等．大孔吸附樹脂純化油茶籽多酚的研究［J］．食品與機械，2009，25（1）：61～63，85．

6 袁英姿，曹清明，鐘海雁，等．油茶籽多酚對茶油的抗氧化性的研究［J］．食品工業(yè)科技，2009，30（6）：103～105．

7 毛方華，王鴻飛，林燕，等．油茶籽毛油中多酚類物質(zhì)對自由基的清除作用［J］．中國糧油學報，2010，25（1）：64～68．

8 陳虹霞，王成章，葉建中，等．油茶餅粕中黃酮苷類化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定［J］．林產(chǎn)化學與工業(yè)，2011，31（1）：13～16．

9 Yoshida T，Nakazawa T，Hatano T，et al．A dimeric hydrolysable tannin fromCamellia oleifera［J］．Phytochemistry，1994，37（1）：241～244．

10 Daisuke Mukai，Noriko Matsuda，Yu Yoshioka，et al．Potential anthelmintics：polyphenols from the tea plant Camellia sinensis L．a(chǎn)re lethally toxic to Caenorhabditis elegans ［J］．J．Nat Med．，2008（62）：155～159．

11 Chaovanalikit A，Wrolstad R E．Total anthocyanins and total phenolics of fresh and processed cherries and their antioxidant properties［J］．Food Chemistry and Toxicology，2004，69（1）：67～72．