大鼠灌胃冬凌草乙素的藥代動力學研究

杜鵬強， 李曉天， 石迎迎， 于 彤

(1．鄭州大學 藥學院 河南鄭州450001;2．河南省人民醫(yī)院 河南鄭州450001)

0 引言

冬凌草系唇形科植物碎米椏Rabdosiarubescens(Hemsl．)Hara的全草，主要分布于河南及黃河流域以南，主產(chǎn)地在河南濟源太行山一帶［1］，其味甘苦，性微寒，主要用于咽喉腫痛、扁桃腺炎、蛇蟲咬傷等癥．臨床實驗證明冬凌草對食管癌、賁門癌、肝癌等有一定療效［2－5］．冬凌草乙素作為冬凌草的抗腫瘤有效成分之一，具有顯著的抗血管原活性而抑制前列腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移［6］，能在體外誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡［7］，能顯著抑制人乳腺癌和肝癌細胞的生長［8－9］，抑制髓細胞性白血病細胞增殖及單核細胞性白血病細胞的生長［10－11］．到目前為止，關(guān)于冬凌草乙素在大鼠體內(nèi)的藥動學研究尚未見報道．本文通過對大鼠灌胃冬凌草乙素，進行臨床前藥代動力學研究．

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

美國Agilent 1200高效液相色譜儀，包括G1322A型在線真空脫氣機，G1311A型四元輸液泵，G1313A型自動進樣器，G1316A型柱溫箱及G1314A型可變波長紫外檢測器．冬凌草乙素由鄭州大學新藥研發(fā)中心提供;非那西丁(內(nèi)標)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品;甲醇為色譜純，乙酸乙酯為分析純，均為天津四友化學試劑有限公司產(chǎn)品;超純水為美國Milli-Q超純水系統(tǒng)．

1．2 動物

健康成年SD大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，由河南省實驗動物中心提供．

1．3 色譜條件

色譜柱為 Eclipse XDB C18 柱((150 mm ×4．6 mm，5 μm);美國 Agilent公司);預(yù)柱為 C18 柱((12．5 mm ×4．6 mm，5 μm);美國 Agilent公司);流動相為甲醇 － 水(46∶54，V/V);流速為 1．0 mL/min;進樣量為20 μL;柱溫為25℃;檢測波長為232 nm．

1．4 血漿樣品處理

100 μL 大鼠血漿中，加入10 μL Vc 溶液(20 g/L)，10 μL 內(nèi)標(IS)溶液 (20 μg/L 非那西丁)，渦旋混勻30 s，加入3 mL乙酸乙酯，渦旋震蕩3 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液于40℃真空濃縮至干，殘渣加100 μL流動相復(fù)溶，13 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL注入 HPLC儀進樣分析．

1．5 實驗方法

SD大鼠6只，雌雄各半，給藥前12 h禁食，自由飲水．以20 mg/kg的劑量對大鼠進行灌胃給藥．給藥前采集空白血樣，給藥后分別于 0．083，0．25，0．5，1．0，1．5，2．0，3．0，4．0，6．0，8．0，12．0，24．0 h 于眼眶靜脈叢采血300 μL置肝素化離心管中，4 000 r/min離心5 min，取上層血漿100 μL，按1．4操作，注入HPLC儀進行分析．根據(jù)當日標準曲線，求得血漿藥物濃度．

1．6 數(shù)據(jù)分析

采用3P97軟件進行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)繪制血藥濃度－時間曲線，并采用非房室模型法計算各藥動學參數(shù):以半對數(shù)作圖法，由末端相4個濃度點計算消除速率常數(shù)ke，并用公式0．693/ke計算半衰期T1/2．采用梯度法計算AUC0－t，并以末端點的血藥濃度除以 ke，計算外推至無窮大的 AUCt－∞．清除率 CL由X0/AUC0－∞計算得到．

2 結(jié)果

2．1 色譜行為

HPLC法測定冬凌草乙素時，專屬性強，靈敏度高．冬凌草乙素和內(nèi)標非那西丁的保留時間分別為4．61 min和5．69 min(圖1)，大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾冬凌草乙素的測定．

圖1 冬凌草乙素的色譜圖Fig．1 Chromatogram of ponicidin

2．2 冬凌草乙素在大鼠血漿中的標準曲線

取大鼠空白血漿100 μL，加入冬凌草乙素系列標準溶液10 μL，配制成相當于冬凌草乙素血漿濃度分別為 50，100，200，500，1 000，2 000，5 000 μg/L 的血漿樣品，按 1．4 操作，進樣 20 μL，記錄色譜圖;以待測物濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，以最小二乘法進行線性回歸，求得的回歸方程即為標準曲線，標準曲線方程為 y=0．000 147x－0．009 307(r=0．998 1)．

2．3 精密度與準確度

取大鼠空白血漿100 μL，按2．2節(jié)的方法配制低、中、高3個濃度(冬凌草乙素的血漿濃度分別為100，1 000和5 000 μg/L)的質(zhì)控(QC)樣品，每一濃度進行6樣本分析，連續(xù)測定3天．根據(jù)當日標準曲線，計算QC樣品的測得濃度，根據(jù)QC樣品結(jié)果計算本法的精密度與準確度，數(shù)據(jù)見表1．實驗數(shù)據(jù)表明，該分析方法符合有關(guān)國際規(guī)范的要求．

表1 大鼠血漿中乙素的回收率和精密度(n=6，Mean±SD)Tab．1 Recovery and precision of ponicidin in plasma(n=6，Mean±SD)

2．4 方法回收率

取大鼠空白血漿100 μL，加入冬凌草乙素標準溶液10 μL，按1．4操作，配制低、中、高3個濃度(冬凌草乙素的血漿濃度分別為100，1 000和5 000 μg/L)的QC樣品，每一濃度進行6樣本分析．同時配制相應(yīng)濃度的冬凌草乙素標準溶液，進樣分析．以每一濃度血漿樣品與標準溶液中冬凌草乙素的峰面積比值計算回收率．3 種濃度下冬凌草乙素的萃取回收率分別為(74．8 ±4．9)%，(68．8 ±4．5)%，(67．1 ±5．2)%(見表1)．內(nèi)標非那西丁經(jīng)同樣處理，回收率為(88．9±5．8)%．

2．5 大鼠灌胃給藥后藥代動力學

6只大鼠灌胃冬凌草乙素20 mg/kg后，測定不同時間的血藥濃度，血藥濃度—時間曲線見圖2．其中B是A的半對數(shù)坐標圖．

圖2 大鼠灌胃給藥20 mg/kg乙素后的血藥濃度—時間曲線Fig．2 Mean plasma concentration-time curve of ponicidin after i．g．20 mg/kg in rats

采用非房室模型法，求算出各主要藥動學參數(shù) AUC0－t，AUCt－∞，ke，T1/2，CL/F，Cmax，Tmax分別為(9．85 ±2．89 mg·h/L，(11．81 ±3．45)mg·h/L，(0．11 ±0．04)h－1，(3．52 ±1．16)h，(1．08 ±0．10)L/(kg·h)，(3．07 ±2．30)μg/L，(0．67 ±0．33)h，見表 2．

3 討論

本文的血漿樣品用乙酸乙酯作為提取溶劑，內(nèi)標非那西丁和冬凌草乙素在低、中、高各濃度均能獲得較高且較穩(wěn)定的提取回收率．在對冬凌草乙素的結(jié)構(gòu)類似物冬凌草甲素進行考察時發(fā)現(xiàn)，在冬凌草甲素與冬凌草乙素達到色譜分離的情況下，冬凌草甲素容易受到血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，而非那西丁與冬凌草乙素的色譜保留時間相近且又能完全分開，不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，因此選用非那西丁作為內(nèi)標物．在考察穩(wěn)定性時，冬凌草乙素血漿樣品室溫放置2 h后會降至60%～70%，所以考察了不同濃度及不同體積的酶活性抑制劑氟化鈉溶液以及抗氧化劑Vc溶液的穩(wěn)定作用．實驗結(jié)果表明，向100 μL 血漿樣品中加入 10 μL Vc溶液(20 g/L)，可有效防止冬凌草乙素的降解(RE在±15%內(nèi))，保證了測定結(jié)果的準確可靠．

本文建立了大鼠灌胃后血漿中冬凌草乙素的高效液相色譜測定法．采用乙酸乙酯對血漿樣品進行預(yù)處理，以非那西丁為內(nèi)標，對血漿中的冬凌草乙素進行測定．樣品處理過程操作簡單，冬凌草乙素在血漿濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，定量下限達50 μg/L，該方法專屬性強，精密度高，準確可靠，成功的用于冬凌草乙素在大鼠體內(nèi)的藥動學研究．

表2 大鼠灌胃給藥20 mg/kg乙素后的主要藥代動力學參數(shù)(n=6)Tab．2 Main pharmacokinetics parameters of ponicidin after i．g．20 mg/kg in rats(n=6)

通過灌胃這種口服給藥方式，對大鼠灌胃冬凌草乙素進行臨床前藥代動力學的研究，得出相應(yīng)的藥動學參數(shù)．從藥動學參數(shù)T1/2(3．52±1．16)h中，可以得出冬凌草乙素在大鼠體內(nèi)消除較快，在體內(nèi)不易蓄積．同時為冬凌草乙素進一步的研究提供依據(jù)，特別是為冬凌草乙素的口服給藥方式的研究提供依據(jù)．

［1］ 河南省醫(yī)學科學研究所藥理藥化組，河南醫(yī)學院化學教研組，云南省植物研究所植物化學研究室，等．冬凌草的化學及藥理作用研究［J］．中草藥通訊，1977(10):5－7．

［2］ Zhang Dianrui，Ren Tianchi．Effects of oridonin［J］．Chin Pharm J，2003，38(11):817 －820．

［3］ Zhu Yu，Xie Liping，Chen Guang，et al．Effects of oridonin on proliferation of HT29 human colon carcnoma cell lines both in vitro and in vivo in mice［J］．Phar Mazie，2007，62(6):439 －444．

［4］ 李欽，馮衛(wèi)生．冬凌草化學成分、藥理作用及開發(fā)研究進展［J］．河南中醫(yī)學院院報，2003，6(18):31－33．

［5］ 左海軍，李丹，吳斌等．冬凌草的化學成分及其抗腫瘤活性［J］．沈陽藥科大學學報，2005，22(4):258－262．

［6］ Meade-Tollin L C，Wijerate E M，Cooper D，et al．Ponicidin and oridonin are responsible for the antiangiogenic activity of Rabdosia rubescens，a constituent of the herbal supplement PC SPES［J］．J Nat Prod，2004，67(1):2 －4．

［7］ Liu Jiajun，Huang Renwei，Lin Dongjun，et al．Poncidin，an ent-kaerane diterpenoid derived from a constituent of the herbal supplement PC-SPES，Rabdosia rubescens，induces apoptosis by activation of capspase-3 and mitochondrial events in lung cancer cells in vitro［J］．Cencer Invest，2006，24(2):136 －148．

［8］ Hsich T C，Wijerratne E K，Liang J Y，et al．Differential control of growth，cell cycle progression，and expression of NF-kappaB in human breast cancer cells MCF-7，MCF-10A，and MDA-MB-231 by ponicidin and oridonin，diterpenoids from the Chinese herb Rabdosia rubescens［J］．Biochem Biophys Res Commun，2005，337(1):224 －231．

［9］ Zhang Junfeng，Liu Peiqing，Chen Guihua，et al．Ponicidin inhibits cell growth on hepatocellular carcinoma cells by induction of apoptosis［J］．Dig Liver Dis，2007，39(2):160 －166．

［10］ Liu Jiajun，Huang Renwei，Lin Dongjun，et al．Antiproliferation effects of ponicidin on human myeloid leukemia cells in vitro［J］．Oncol Rep，2005，13(4):653 －657．

［11］ Liu Jiajun，Zhang Yong，Guang Weibin，et al．Ponicidin inhibits monocytic leukemia cell growth by induction of apoptosis［J］．Int J Mol Sci，2008，9(11):2265 －2277．