蘇云金芽胞桿菌基因組研究

喻子牛，王階平，何 進(jìn)

(農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070)

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)廣泛分布于土壤、水、塵埃、昆蟲(chóng)尸體和植物等生境中，是一種典型的革蘭陽(yáng)性菌，營(yíng)養(yǎng)體呈桿狀，在穩(wěn)定期后期開(kāi)始形成一個(gè)卵圓形的芽胞(spore)，伴隨芽胞的形成，在菌體內(nèi)同時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)不同形態(tài)的伴胞晶體(parasporal crystal)，這是區(qū)別于蠟狀芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌的顯著特點(diǎn)［1］。蘇云金芽胞桿菌的伴胞晶體是由不同的的殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)組成的，不同菌株產(chǎn)生不同種類(lèi)的 ICPs。至今，已發(fā)現(xiàn)的760個(gè)ICPs被歸為72個(gè) Cry群和3個(gè) Cyt群。ICPs的多樣性賦予其對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、同翅目等昆蟲(chóng)，以及動(dòng)植物線蟲(chóng)、蜱螨等節(jié)肢動(dòng)物甚至癌細(xì)胞都有特異性的毒殺活性，而對(duì)非目標(biāo)生物安全［2］。因此，目前蘇云金桿菌商品制劑已達(dá)100多種，是世界上應(yīng)用最為廣泛、用量最大、效果最好的微生物殺蟲(chóng)劑。一系列的研究也提示蘇云金芽胞桿菌是已知的最安全的微生物制品之一［3］。近年來(lái)，在轉(zhuǎn)基因作物中成功表達(dá)了一些ICPs而賦予其可遺傳的抗蟲(chóng)能力，不僅提高了產(chǎn)量而且極大地減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用［4］。此外，蘇云金芽胞桿菌還產(chǎn)生具有廣譜殺蟲(chóng)活性的蘇云金素(thuringiensin)［5］、抗病作用的雙效菌素(zwittermicin A)［6］等。近幾年，國(guó)內(nèi)外研究人員在蘇云金芽胞桿菌的基因組學(xué)和功能基因組學(xué)領(lǐng)域開(kāi)展了大量而深入的研究，并取得了豐富的研究成果。本文擬就蘇云金芽胞桿菌的基因組研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要論述。

1 蘇云金芽胞桿菌基因組測(cè)序

2004年6月30日美國(guó)能源部聯(lián)合基因組研究所宣布完成了蘇云金芽胞桿菌serovar konkukian 97－27 的全基因組測(cè)序工作［7］。konkukian 97－27是從人體的壞死骨組織上分離得到的，通過(guò)動(dòng)物活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明它能引起與炭疽熱類(lèi)似的疾?。?］。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析結(jié)果顯示該菌與炭疽芽胞桿菌很接近，但konkukian 97－27的生理生化指標(biāo)與蘇云金芽胞桿菌更為相似，該菌株并不具有任何殺蟲(chóng)活性，其全基因組序列中也不含有與殺蟲(chóng)毒性相關(guān)的編碼基因。因此，盡管konkukian 97－27是第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的菌株，但它并不是一株典型意義上的蘇云金芽胞桿菌。

隨著研究的深入，特別是第二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，有大量的蘇云金芽胞桿菌菌株進(jìn)行了基因組測(cè)序。至2013年3月底，已有26株蘇云金芽胞桿菌完成全基因組測(cè)序工作，1株正在進(jìn)行拼接，另有26株蘇云金芽胞桿菌(包括華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的 3 個(gè)菌株 YBT－1518、YBT－1520 和 YBT－1765)的全基因組測(cè)序正在進(jìn)行中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/486)。在已完成全基因組測(cè)序的蘇云金芽胞桿菌中，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)完成測(cè)序工作的菌株包括BMB171［9］、YBT－020［10］和 CT－43［11］。

2 蘇云金芽胞桿菌基因組結(jié)構(gòu)及特征

蘇云金芽胞桿菌染色體為環(huán)狀DNA，基因組全長(zhǎng)為5.31 ～6.77 Mb不等，GC 含量在34.5% ～35.6% 之間［7，9－11］。下面分別介紹已完成全基因組測(cè)序的幾個(gè)典型菌株基因組結(jié)構(gòu)及特征。菌株konkukian 97－27 基因組全長(zhǎng)5.31 Mb，包括2 個(gè)復(fù)制子:1個(gè)環(huán)狀染色體，編碼至少5 198個(gè)開(kāi)放閱讀框，1個(gè)質(zhì)粒pBT9727;沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何與cry、cyt或vip基因有同源性的基因［7］。菌株Al Hakam基因組為5.31 Mb，包括2個(gè)復(fù)制子:1個(gè)環(huán)狀染色體(5.26 Mb)編碼 4 969個(gè) ORFs，1個(gè)質(zhì)粒pALH1;也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與cry、cyt或vip基因具有同源性的基因［12］。菌株 CT－43是第1株完成全基因組測(cè)序的含殺蟲(chóng)晶體蛋白基因的蘇云金芽胞桿菌菌株，基因組全長(zhǎng)6.15 Mb，包括11個(gè)復(fù)制子:1個(gè)環(huán)狀染色體(5.26 Mb)，編碼5 529個(gè) ORFs，和10個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒共編碼737個(gè)ORFs;它至少產(chǎn)6種毒素蛋白(Cry1Aa3、Cry1Ba1、Cry1Ia14、Cry2Aa9、Cry2Ab1和Vip3Aa10);還編碼104個(gè)tRNAs基因和13個(gè)rRNA 操縱子［11］。菌株 YBT－020的全基因組包括3個(gè)復(fù)制子:1個(gè)環(huán)狀染色體(5.35 Mb)編碼5 477個(gè)ORFs，2個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒，分別編碼200和149個(gè)ORFs;染色體的GC含量為35.5%，2質(zhì)粒的GC含量分別為33.1%和33.9%;基因組編碼107個(gè) tRNAs基因和14個(gè) rRNA操縱子［10］。無(wú)晶體突變菌株BMB171的全基因組長(zhǎng)5.64 Mb，包括2個(gè)復(fù)制子:1個(gè)環(huán)狀染色體(5.33 Mb)編碼5 088個(gè)ORFs和1個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒 pBMB171編碼276個(gè)ORFs;基因組編碼104個(gè)tRNAs和14個(gè)rRNA操縱子［9］。菌株 YBT－1520是高毒力菌株，盡管還沒(méi)有獲得基因組精細(xì)圖，但是已經(jīng)獲得完成圖:1個(gè)環(huán)狀染色體，大小約為5.4 Mb，共編碼5 556個(gè)ORFs;10個(gè)質(zhì)粒，含有5種殺蟲(chóng)晶體蛋白基因，主要集中在質(zhì)粒 pBMB293上(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

3 蘇云金芽胞桿菌的質(zhì)粒

蘇云金芽胞桿菌的重要特性是含有豐富多樣的內(nèi)生質(zhì)粒，其質(zhì)粒DNA的含量占到細(xì)胞總DNA的10%～20%。在NCBI中共有23個(gè)質(zhì)粒提交了全序列。不同亞種，甚至同一亞種不同菌株所攜帶質(zhì)粒的數(shù)量和分子大小差異很大，從1個(gè)到多達(dá)14個(gè)，分子大小由2 kb到250 kb不等。其中，菌株YBT－1520含有大小從2 kb到416 kb的11個(gè)質(zhì)粒;質(zhì)粒拷貝數(shù)從1.38到172，且與質(zhì)粒大小成反比;在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，質(zhì)粒的總DNA 含量(約8.7 Mb)是染色體DNA含量(約5.4 Mb)的 1.62 倍［13］。

我們的研究表明，菌株CT－43的10個(gè)質(zhì)粒所編碼的基因大多數(shù)是功能未知的，但包括大量的與結(jié)合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)座、插入等相關(guān)的轉(zhuǎn)座酶與整合酶。CT－43中最值得關(guān)注的是pCT281和pCT127這2個(gè)大質(zhì)粒。首先，賦予CT－43殺蟲(chóng)活性的6個(gè)毒素蛋白的編碼基因分別位于這2個(gè)質(zhì)粒上:cry1Aa3、cry1Ia14、cry2Aa9、cry2Ab1 和 vip3Aa10 位于pCT281的毒力島上，而Cry1Ba1位于pCT127上。第二，蘇云金素的生物合成基因簇位于pCT127上［5］。第三，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其相關(guān)蛋白是針對(duì)噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA的獲得性和可遺傳的免疫系統(tǒng)，已成為微生物學(xué)研究的新的熱點(diǎn)領(lǐng)域;我們?cè)趐CT281上不僅發(fā)現(xiàn)了2個(gè)CRISPR座位，還找到了7個(gè) CRISPR相關(guān)蛋白:1個(gè) Cas5和6個(gè)Csd2［14－15］。第四，我們發(fā)現(xiàn)在 pCT281 上存在1 個(gè)可能在同類(lèi)相殘(cannibalism)［16］中發(fā)揮功能的基因簇 pCT281.250－254。

4 蠟狀芽胞桿菌群的比較基因組

在蠟狀芽胞桿菌群中，蘇云金芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、蠟狀芽胞桿菌具有較高的DNA同源性和相似的形態(tài)特征，關(guān)系密切。盡管這3種細(xì)菌具有非常顯著的表型差異:蘇云金芽胞桿菌為昆蟲(chóng)致病菌、蠟狀芽胞桿菌為食源性條件致病菌、炭疽芽胞桿菌為人和動(dòng)物炭疽病原菌［17］，但是它們的基因組具有很高的序列同源性和共線性。炭疽芽胞桿菌、蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌的主要區(qū)別在于所攜帶質(zhì)粒的不同［18］。例如，蘇云金芽胞桿菌與蠟狀芽胞桿菌的差別僅在于前者在形成芽胞時(shí)可以產(chǎn)生伴胞晶體，而伴胞晶體有毒性質(zhì)粒編碼，一旦該質(zhì)粒丟失，蘇云金芽胞桿菌可以轉(zhuǎn)變?yōu)橄灎钛堪麠U菌。因此，基于16S rRNA，16S～23S rRNA基因間區(qū)的方法都很難區(qū)分3種菌，目前普遍使用的方法是運(yùn)用多基因標(biāo)簽(如AFLP，MLST，MLEE等)的方法來(lái)進(jìn)行聚類(lèi)分析［19－21］。

雖然蘇云金芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌和蠟狀芽胞桿菌是不同種還是同一種間的不同分支現(xiàn)在仍無(wú)定論，但是在蠟狀芽胞桿菌群中，炭疽芽胞桿菌因其是炭疽病的病原菌而最受人們關(guān)注。早期，人們認(rèn)為炭疽芽胞桿菌區(qū)別于其他蠟狀芽胞桿菌群細(xì)菌的主要特點(diǎn)在于:炭疽芽胞桿菌存在4個(gè)前噬菌體、plcR調(diào)節(jié)因子的無(wú)義突變、pXO1和 pXO2 質(zhì)粒［17，22－23］。但我們的研究表明，蘇云金芽胞桿菌也含有多個(gè)前噬菌體(CT－43有6個(gè)前噬菌體)。有些菌株不存在plcR調(diào)節(jié)因子的無(wú)義突變，卻存在與pXO1和pXO2相似的質(zhì)粒［24］。最近，通過(guò)45個(gè)菌株的比較基因組學(xué)研究，仍然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炭疽芽胞桿菌具有明顯的基因缺失或積累現(xiàn)象［25］。盡管如此，炭疽芽胞桿菌致病性相關(guān)的基因是在進(jìn)化史上近期通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移而獲得的觀點(diǎn)得到廣泛認(rèn)同的［25］。

5 蘇云金芽胞桿菌轉(zhuǎn)錄組

我們通過(guò)Illumina高通量測(cè)序(RNA－seq)技術(shù)分析了CT－43菌株的轉(zhuǎn)錄組學(xué)［26］。去低值后，獲得的凈 reads平均讀長(zhǎng)為110 nt，7、9、13 和22 h這4個(gè)樣品的總凈 reads數(shù)分別為 926755、1096665、577810和1493721。這樣，4個(gè)時(shí)期樣品的測(cè)序覆蓋度達(dá)到了10到27倍，均獲得了理想的測(cè)序深度。結(jié)果表明，CT－43染色體編碼的ORFs在4個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄比率分別為40.9%、43.1%、53.2%和 17.7%，說(shuō)明 13 h 的轉(zhuǎn)錄最為活躍。

顯然，保持轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器的高效運(yùn)轉(zhuǎn)對(duì)芽胞和伴胞晶體的形成是至關(guān)重要的。我們的研究結(jié)果表明，RNA聚合酶復(fù)合物的δ和ω亞基、冷休克蛋白、Sig因子和轉(zhuǎn)錄因子以不同的機(jī)制協(xié)同地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。重要的是，在芽胞形成期，核糖體蛋白、tRNA、rRNA的差異加工和修飾加之翻譯抑制作用的解除極大地加快了核糖體的周轉(zhuǎn)和組裝速率，提高了翻譯起始、延伸和終止效率，因而可以補(bǔ)償核糖體數(shù)量上的減少。RNA－seq結(jié)果顯示，大多數(shù)cry基因和芽胞結(jié)構(gòu)、組裝與成熟相關(guān)的基因在芽胞形成期特異性表達(dá)。在母細(xì)胞裂解之前，細(xì)胞團(tuán)的解聚是首先發(fā)生的重要事件，除了一些水解酶和蛋白酶外，D－氨基酸和某種精胺也一起參與細(xì)胞團(tuán)的解聚。在母細(xì)胞裂解的過(guò)程中，許多在22 h特異表達(dá)和顯著上調(diào)的基因先后發(fā)揮功能而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的破裂、細(xì)胞壁的崩解以及DNA的降解。

我們研究發(fā)現(xiàn)，在芽胞形成期許多蛋白酶和氨基酸代謝(特別是支鏈氨基酸)變得更加活躍。對(duì)數(shù)期儲(chǔ)存的聚β－羥基丁酸和羥基丁酮、一些“低質(zhì)”原料和非產(chǎn)芽胞細(xì)胞的裂解(同類(lèi)相殘)一起為芽胞和伴胞晶體的形成提供大量的碳源和能源物質(zhì)。而且，當(dāng) CT－43生長(zhǎng)在 GYS培養(yǎng)基時(shí)，磷酸戊糖途徑就會(huì)呈現(xiàn)出一個(gè)十分有趣的調(diào)節(jié)現(xiàn)象。特別提出的是，三羧酸循環(huán)在芽胞形成期被明顯修正與補(bǔ)充。與通過(guò)電子傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生能量相關(guān)的酶和色素在數(shù)量上顯著增加。最后，ATP合成酶(F0F1－ATPase)的大多數(shù)亞基在芽胞形成期顯著上調(diào)。

我們的研究結(jié)果首次從轉(zhuǎn)錄組水平系統(tǒng)地揭示:①與芽胞和伴胞晶體形成、芽胞成熟和母細(xì)胞裂解相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制;②與芽胞和伴胞晶體形成相關(guān)的氨基酸、能源物質(zhì)來(lái)源和能量供應(yīng)的代謝調(diào)控機(jī)制［26］。

6 蘇云金芽胞桿菌蛋白質(zhì)組

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍已擴(kuò)大到研究動(dòng)物、植物和微生物等領(lǐng)域。近年來(lái)，蘇云金芽胞桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究越來(lái)越多，以研究殺蟲(chóng)晶體蛋白在昆蟲(chóng)中腸的刷狀緣膜囊泡中的結(jié)合受體、研究殺蟲(chóng)毒素在昆蟲(chóng)中腸的結(jié)合蛋白。這些研究能夠更好地了解毒素在昆蟲(chóng)中腸的作用機(jī)理，對(duì)進(jìn)一步研究殺蟲(chóng)晶體蛋白的作用機(jī)制及昆蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生都有重要的意義。我們對(duì)菌株YBT－1520進(jìn)行高溫條件下蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果表明，在42℃處理后某些與芽胞和殺蟲(chóng)晶體蛋白形成有關(guān)的蛋白表達(dá)會(huì)下調(diào)［27］。蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要是針對(duì)蛋白質(zhì)的研究，與蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白的產(chǎn)生相關(guān)的蛋白已鑒定出很多，對(duì)高產(chǎn)蘇云金素的蘇云金芽胞桿菌野生菌株CT－43、高產(chǎn)突變菌株CT－43－1C及不產(chǎn)突變菌BMB0806在蛋白表達(dá)水平的差異研究顯示，在菌株BMB0806中發(fā)現(xiàn)有6個(gè)蛋白質(zhì)可能與蘇云金素合成或代謝相關(guān)，這為研究蘇云金素合成基因簇的克隆和合成途徑提供了有力的證據(jù)［28］。最近，我們通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究還揭示了蘇云金芽胞桿菌不同生長(zhǎng)時(shí)期的代謝途徑規(guī)律，以及PHB代謝對(duì)芽胞和伴胞晶體形成的影響［29－30］。

7 蘇云金芽胞桿菌代謝組

代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的新興學(xué)科。對(duì)蘇云金芽胞桿菌菌株YBT－1532產(chǎn)生的蘇云金素的代謝調(diào)控的研究提出，蘇云金素的生物合成代謝與腺嘌呤從頭合成途徑有關(guān)［31］，可以通過(guò)提高腺嘌呤的合成前體—甲酸鈉的濃度來(lái)增加蘇云金素的產(chǎn)量。蘇云金芽胞桿菌代謝方面的研究不再局限在發(fā)酵研究上，也有對(duì)某條代謝途徑的研究，蠟狀芽胞桿菌群能夠分泌鐵載體，但是蠟狀芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌能分泌2種鐵載體:petrobactin和bacillibactin，而能產(chǎn)生殺蟲(chóng)晶體蛋白的蘇云金芽胞桿菌菌株ATCC 33679只能分泌bacillibactin，這是由于編碼鐵載體基因的bacACEBF操縱子上缺乏asbB基因所導(dǎo)致，據(jù)推測(cè)其中一種鐵載體petrobactin與檸檬酸循環(huán)有關(guān)，進(jìn)而影響殺蟲(chóng)晶體蛋白基因的表達(dá)，這些結(jié)果為研究殺蟲(chóng)晶體蛋白的形成機(jī)制提供了新思路。

代謝組學(xué)不僅在代謝網(wǎng)絡(luò)模型、代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能分析以及微生物發(fā)酵中越來(lái)越重要，而且在代謝工程研究和生化工程控制中發(fā)揮重要作用。更為重要的是，從基因組重建得到代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝途徑分析［32］，將在未來(lái)的系統(tǒng)生物學(xué)研究中確定物種的性質(zhì)，在代謝工程研究中，通過(guò)控制代謝途徑上的關(guān)鍵酶或改變影響該代謝途徑的外界因素，控制代謝流向，促進(jìn)或抑制某條代謝途徑，提高其利用率，指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)等方面發(fā)揮更加重要的作用。

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