16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序在細(xì)菌鑒定與分類中的應(yīng)用

朱詩(shī)應(yīng)，戚中田

第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，上海市醫(yī)學(xué)生物防護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

細(xì)菌檢測(cè)包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢查、分離培養(yǎng)、生化鑒定、免疫分析等多種方法，其中細(xì)菌的分離培養(yǎng)最為關(guān)鍵，但對(duì)苛養(yǎng)菌及生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌分離培養(yǎng)很棘手。近年來(lái)，各種基因診斷技術(shù)在細(xì)菌檢測(cè)中不斷開發(fā)、利用，尤其是基于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的基因診斷技術(shù)發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。本文就細(xì)菌核糖體小亞基16S RNA的基因(16S rDNA)在細(xì)菌鑒定與分類中的應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述。

1 16S rDNA

16S rDNA是編碼原核生物16S rRNA的基因，長(zhǎng)度約1 500 bp，存在于所有細(xì)菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌等原核生物的基因組中，由多個(gè)保守區(qū)(conserved region)和與之相間的多個(gè)可變區(qū)(variable region)組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌之間無(wú)顯著差異[1]；可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在一定程度的差異，具有細(xì)菌屬或種特異性。PCR擴(kuò)增16S rDNA包含兩層含義：在保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR通用引物，理論上可將存在于待測(cè)標(biāo)本中的各種細(xì)菌都擴(kuò)增出來(lái)；若選擇可變區(qū)設(shè)計(jì)PCR特異性引物，則可將標(biāo)本中的細(xì)菌鑒定到屬、種乃至菌株水平。因此，16S rDNA已成為細(xì)菌鑒別與分類研究中較理想的靶序列[2]。

2 基于16S rDNA可變區(qū)序列的應(yīng)用研究

細(xì)菌16S rDNA中含有9個(gè)可變區(qū)[3]，命名為V1～V9區(qū)。確定某個(gè)可變區(qū)內(nèi)具有細(xì)菌種特異性的序列就可能獲得細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室診斷的有用靶點(diǎn)。除V2、V3、V4區(qū)稍長(zhǎng)外，其他各高變區(qū)序列都很短，沒有哪個(gè)高變區(qū)能區(qū)分所有細(xì)菌[4]。Chakravorty等[5]對(duì)110種細(xì)菌(分別來(lái)自于人體、環(huán)境及美國(guó)疾病預(yù)防控制中心鑒定的致病菌)共113份完整的16S rDNA的V1～V8區(qū)序列進(jìn)行詳細(xì)研究，分別構(gòu)建了基于V1～V8區(qū)序列的特異性系統(tǒng)樹(dendrogram)。結(jié)果顯示，V1區(qū)能區(qū)分金黃色葡萄球菌與血漿凝固酶陰性葡萄球菌；V2和V3區(qū)能將除腸桿菌科以外的細(xì)菌鑒別至屬的水平，V2區(qū)尤其適合于鑒別分枝桿菌屬內(nèi)的菌種，V3區(qū)能很好區(qū)別嗜血桿菌屬內(nèi)各種細(xì)菌；V6區(qū)也能區(qū)分除腸桿菌科以外的大多數(shù)菌種，特別是通過(guò)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析可將炭疽芽胞桿菌從與其生物學(xué)性狀非常相似的蠟樣芽胞桿菌群細(xì)菌中區(qū)分開來(lái)；而通過(guò)V4、V5、V7和V8區(qū)序列來(lái)鑒別細(xì)菌至屬或菌種的可能性不大。Jacob等[6]收集了31株弗朗西斯菌屬的細(xì)菌及96份臨床分離株，通過(guò)對(duì)16S rDNA V1區(qū)37個(gè)核苷酸片段的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，不僅能將臨床或環(huán)境標(biāo)本中的弗朗西斯菌屬成功鑒定出來(lái)，結(jié)合SNP分析(根據(jù)第12位核苷酸T/G不同)還可將弗朗西斯菌屬的細(xì)菌分成2個(gè)組，引起人類和動(dòng)物土拉熱病的土拉熱弗朗西斯菌(Francisellatularensis)的3個(gè)亞種均在第1組，其他幾個(gè)菌種則全在第2組。因此，該方法可快速甄別具有強(qiáng)傳染性的土拉熱弗朗西斯菌。

3 基于16S rDNA全長(zhǎng)或部分序列的應(yīng)用研究

3.1 用于鑒定難以培養(yǎng)的細(xì)菌

20世紀(jì)90年代初，Relman等[7]針對(duì)桿菌性血管瘤(bacillary angiomatosis)的細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定一直未獲成功的難題，采用PCR方法從患者組織標(biāo)本中擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA片段，并通過(guò)測(cè)序和比對(duì)分析，首次成功鑒定出該血管瘤的病原菌為伏爾希尼立克次體(Rochalimaeaquintana)。1992年又用同樣方法鑒定出惠普爾病(Whipple’s disease)的病原菌為一種放線菌，并根據(jù)種系進(jìn)化圖譜研究將其系統(tǒng)命名為Tropherymawhippelii[8]。何亮等用PCR從恒河猴陰道分泌物的厭氧菌培養(yǎng)物中擴(kuò)增出特異片段，經(jīng)序列分析成功檢測(cè)出與細(xì)菌性陰道病密切相關(guān)而用一般方法難以純培養(yǎng)的動(dòng)彎桿菌[9]。在心內(nèi)膜炎的細(xì)菌學(xué)診斷中，傳統(tǒng)的血培養(yǎng)或心瓣膜細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率很低。Marín等[10]對(duì)177份心瓣膜標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA通用引物定量PCR擴(kuò)增與測(cè)序，結(jié)果表明定量PCR檢測(cè)的敏感度、特異度、陰性預(yù)期值和陽(yáng)性預(yù)期值分別達(dá)到96%、95.3%、98.4%和88.5%，該法可為心內(nèi)膜炎的及時(shí)處理和抗生素的合理選擇提供參考依據(jù)。

3.2 用于區(qū)分進(jìn)化關(guān)系密切的細(xì)菌

炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌三者基因序列的同源性>99%，相互之間鑒別較難，被稱為蠟樣芽胞桿菌群(Bacilluscereusgroup)，甚至有學(xué)者認(rèn)為三者屬于同一個(gè)種[11]。Sacchi等[12]對(duì)不同地區(qū)的107株細(xì)菌(包括86株炭疽芽胞桿菌、10株蠟樣芽胞桿菌和11株蘇云金芽胞桿菌)進(jìn)行全長(zhǎng)16S rDNA的擴(kuò)增和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在全長(zhǎng)1 554 bp序列中存在8處SNP差異，據(jù)此可分為不同16S基因型，86株炭疽芽胞桿菌均屬其中的第6型。在198份待測(cè)臨床標(biāo)本中檢測(cè)出該基因6型陽(yáng)性標(biāo)本7份，而這7份標(biāo)本均來(lái)自于臨床確診的炭疽患者。結(jié)果顯示，16S rDNA測(cè)序方法不僅可將這3種關(guān)系相近的芽胞桿菌準(zhǔn)確區(qū)別開來(lái)，還能直接對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，適合于生物恐怖事件中對(duì)炭疽芽胞桿菌的快速鑒定。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌等細(xì)菌雖然存在明顯的表型(phenotype)差異和致病性差異，但通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌ATCC 27294株、牛分枝桿菌ATCC 19210株、非洲分枝桿菌ATCC 25420株的16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)三者16S rDNA沒有任何堿基差異，基因型(genotype)完全相同，據(jù)此將它們確定為一個(gè)種內(nèi)的不同亞種(subspecies)[13]。

3.3 用于鑒定血液培養(yǎng)的細(xì)菌

王永智等[14]在對(duì)20余種致病菌進(jìn)行16S rDNA多序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的熒光定量PCR通用引物，檢測(cè)血液細(xì)菌污染模擬標(biāo)本，靈敏度可達(dá)105CFU/ml。應(yīng)燕玲等[15]通過(guò)13種標(biāo)準(zhǔn)菌株建立了一種基于16S rDNA全長(zhǎng)特異性擴(kuò)增和測(cè)序的方法，利用與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，成功鑒定出血制品污染的11種未知細(xì)菌。Horvat等[16]報(bào)道1例患者第2次住院時(shí)RapID全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定其血培養(yǎng)均為蒼白桿菌，但改用Vitek全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀檢測(cè)，結(jié)果顯示其為羊布魯菌。作者擴(kuò)增該菌的全長(zhǎng)16S rDNA并進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其序列與SmartGene數(shù)據(jù)庫(kù)中25個(gè)布魯菌序列100%同源，后經(jīng)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心確定其血清型為豬布魯菌。Dash等[17]對(duì)1例患者的分離菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，糾正了原來(lái)用MicroScan Walk-Away細(xì)菌鑒定儀作出的錯(cuò)誤結(jié)果，最終確定其為羊布魯菌。這些研究提示，目前使用的全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀在鑒定布魯菌時(shí)可能出現(xiàn)差錯(cuò)，最終確認(rèn)有必要對(duì)分離株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。

美國(guó)Maastricht大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究的實(shí)時(shí)定量16S rDNA PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，利用通用探針外加種或?qū)偬禺愋蕴结樀亩嗵结樂?multiprobe assay)，能在2 h內(nèi)對(duì)血液感染中常見的幾種細(xì)菌包括革蘭陰性的假單胞菌、大腸埃希菌及革蘭陽(yáng)性的葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌等進(jìn)行快速鑒定[18]。該作者還建立了測(cè)定細(xì)菌對(duì)抗生素敏感度的半定量方法，將血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本分別加入不同的抗生素37 ℃培養(yǎng)6 h后，再用定量PCR檢測(cè)細(xì)菌16S rDNA，其對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)大小反映細(xì)菌生長(zhǎng)抑制程度，據(jù)此判斷細(xì)菌對(duì)某種抗生素是敏感或耐藥。該法對(duì)血液感染細(xì)菌的鑒定及藥敏試驗(yàn)?zāi)茉? d內(nèi)完成，與常規(guī)培養(yǎng)及藥敏方法至少需2～3 d相比，在病原診斷和抗生素選擇方面具有快速優(yōu)勢(shì)，有助于菌血癥或敗血癥患者的及時(shí)救治[19]。

3.4 用于發(fā)現(xiàn)細(xì)菌新種類

臨床實(shí)驗(yàn)室碰到一些新的細(xì)菌，因不能明確種類，常難以評(píng)估其潛在的致病性。一般而言，2株菌若16S rDNA全長(zhǎng)的同源性≥99%，為同種細(xì)菌；若在97%～98.9%，一般為同屬不同種；若<95%，則為不同屬。Woo等[20]報(bào)道，2001～2007年全球通過(guò)16S rDNA測(cè)序已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌新種多達(dá)215個(gè)，分別屬于29個(gè)菌屬，其中15個(gè)為新的菌屬，在這15個(gè)新屬中就包括了100個(gè)新種，如Streptococcussinensis、Laribacterhongkongensis、Clostridiumhathewayi、Borreliaspielmaniih等。在這215個(gè)新種中，分枝桿菌屬最多，達(dá)12種，諾卡菌屬第2，有6種。從來(lái)源看，口腔及牙齒相關(guān)標(biāo)本、胃腸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)的新種較多。Schlaberg等[21]對(duì)自2006～2010年臨床分離的26 000多株細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有公開數(shù)據(jù)庫(kù)序列同源性<99%的有673株，表明存在新的種，其中同源性<95%的有111株，表明存在新的屬。在患者標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)95個(gè)新分類單位(novel taxa)，共計(jì)348株分離株。其中最多的是諾卡菌屬，共有42株分離株，14個(gè)新種；其次是放線菌屬，有52株分離株，12個(gè)新種。分離株16S rDNA測(cè)序分析有助于研究這些新菌種與臨床疾病的關(guān)聯(lián)性。

最新版的《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)》就參考16S rDNA序列，不再是依據(jù)表型，而是以系統(tǒng)進(jìn)化框架為基礎(chǔ)進(jìn)行細(xì)菌分類和命名。由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)于2007年領(lǐng)銜啟動(dòng)的人體微生物組項(xiàng)目(Human Microbiome Project，HMP)研究中，16S rDNA測(cè)序是常用手段之一，通過(guò)對(duì)志愿者口腔、鼻腔、消化道、皮膚和泌尿生殖道等不同部位的微生物群落進(jìn)行分析，課題組已公布了從242名成年志愿者中獲得的5 177份16S rDNA序列[22]。16S rDNA測(cè)序作為細(xì)菌分類的一種系統(tǒng)方法，在HMP計(jì)劃中發(fā)揮著重要作用。

3.5 The MicroSeq 500 16S rDNA細(xì)菌鑒定系統(tǒng)

美國(guó)Applied Biosystems公司開發(fā)的The MicroSeq 500 16S rDNA細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，基于擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 5′端的527 bp片段，其引物設(shè)計(jì)針對(duì)所有細(xì)菌，是一種通用的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。標(biāo)本中細(xì)菌16S rDNA經(jīng)擴(kuò)增、測(cè)序后，與該系統(tǒng)自帶的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)分枝桿菌屬、棒狀桿菌屬及諾卡菌屬等細(xì)菌的快速鑒定[13,23]。Cloud等[24]通過(guò)對(duì)119株分枝桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，該法與傳統(tǒng)的表型鑒定結(jié)果符合率達(dá)87%，適合于鑒定生長(zhǎng)非常緩慢的分枝桿菌。有研究表明，該系統(tǒng)對(duì)臨床分離株鑒定至屬和種的準(zhǔn)確率可達(dá)86.5%和81.1%，對(duì)生化檢測(cè)無(wú)法確定的細(xì)菌其鑒定能力甚至強(qiáng)于實(shí)驗(yàn)室常用的3種全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀[23]——Vitek、RapID和API。但該系統(tǒng)對(duì)厭氧革蘭陽(yáng)性桿菌鑒定至屬和種的準(zhǔn)確率稍低，分別為80%和65%，表明其厭氧菌數(shù)據(jù)庫(kù)有待不斷擴(kuò)充[25]。Fontana等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于用Phoenix或Vitek全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀不能鑒定的一些細(xì)菌，該系統(tǒng)也能正確鑒定，顯示其在分離株鑒定中可發(fā)揮重要作用[26]。

4 臨床細(xì)菌鑒定中存在的挑戰(zhàn)和困難

4.1 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增假陽(yáng)性問(wèn)題

盡管細(xì)菌16S rDNA存在多個(gè)保守區(qū)，但沒有針對(duì)哪個(gè)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的PCR引物適合于擴(kuò)增所有細(xì)菌。細(xì)菌、衣原體、螺旋體、立克次體等不同種類微生物之間16S rDNA保守區(qū)雖然存在共有序列(consensus sequence)，但各種類間仍存在若干堿基不同。擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的“通用引物”也是相對(duì)的，通常是在共有序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一套PCR引物[4]。因此，針對(duì)被檢微生物的種類不同或臨床標(biāo)本不同，應(yīng)選擇相對(duì)應(yīng)的通用引物，才能達(dá)到特異擴(kuò)增效果。如果引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，還可出現(xiàn)與人基因組的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致PCR結(jié)果錯(cuò)誤判讀[27]。由于PCR本身的高敏感度，極微量污染也可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。污染可發(fā)生在標(biāo)本采集、核酸提取乃至PCR操作各環(huán)節(jié)，尤其是在標(biāo)本(腦脊液，胸、腹腔積液，心瓣膜或活檢標(biāo)本等)采集環(huán)節(jié)中最易發(fā)生。如采取關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔滑液標(biāo)本時(shí)，應(yīng)避免皮膚表面細(xì)菌污染。在使用通用引物進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增時(shí)，污染細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)。因此，在PCR擴(kuò)增及其測(cè)序的各環(huán)節(jié)都必須建立并遵循標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(standard operating procedure，SOP)[2,20]。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2008年發(fā)布的CLSI指南首次增加了專門針對(duì)細(xì)菌DNA擴(kuò)增及測(cè)序的操作規(guī)范及判斷標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 分離株測(cè)序鑒定的篩選問(wèn)題

細(xì)菌16S rDNA測(cè)序鑒定需進(jìn)行DNA擴(kuò)增、測(cè)序和分析，其設(shè)備條件和實(shí)驗(yàn)成本比傳統(tǒng)的表型鑒定更高，且不能對(duì)所有細(xì)菌都鑒定至種的水平，這是目前一般臨床實(shí)驗(yàn)室尚未普及該項(xiàng)目的原因之一[28]。為評(píng)價(jià)哪些細(xì)菌的確需進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定，Mahlen等[29]設(shè)計(jì)了一套嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選策略，如形態(tài)學(xué)與生化檢測(cè)結(jié)果不一致或十分奇怪的分離株、與疾病的相關(guān)性或解剖位置不相符的分離株、在淺層傷口或呼吸道標(biāo)本存在炎性細(xì)胞時(shí)分離出的優(yōu)勢(shì)菌株、尿道標(biāo)本中分離出的菌量達(dá)104～105CFU/ml的菌株、正常時(shí)無(wú)菌體液中分離出的量很多的菌株等，只對(duì)這些分離株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定。就革蘭陰性桿菌和球菌而言，實(shí)際需進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定的只占其總種類的1.6%。采用一般表型鑒定方法能正確鑒定的絕大多數(shù)分離株不需DNA測(cè)序，以符合臨床細(xì)菌鑒定的低成本、省時(shí)、高效的要求。

4.3 比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)

目前用于細(xì)菌16S rDNA序列檢索和比對(duì)的軟件包及其數(shù)據(jù)庫(kù)主要有以下幾個(gè)。① RDP-Ⅱ：1991年由美國(guó)密西根州立大學(xué)建立，可下載免費(fèi)使用。其序列來(lái)自GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)，序列數(shù)量龐大，其中部分序列無(wú)從考證其準(zhǔn)確性，導(dǎo)致部分序列品質(zhì)不高[1]。截止2012年12月，注冊(cè)的各類16S rDNA達(dá)2 639 157條。② MicroSeq ID：1998年由美國(guó)Applied Biosystems公司研發(fā)，作為有償使用軟件，其與The MicroSeq 500 16S rDNA細(xì)菌鑒定系統(tǒng)配套，包括16S rDNA 5′端527 bp序列和16S rDNA全長(zhǎng)序列2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。其序列源自每種細(xì)菌的一個(gè)純培養(yǎng)菌株的測(cè)序結(jié)果，可靠性高是其最大優(yōu)勢(shì)。最新的527 bp數(shù)據(jù)庫(kù)包含2 020個(gè)序列，16S rDNA全長(zhǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)有1 262個(gè)序列。③ RIDOM：1999年由德國(guó)Ridom GmbH公司開發(fā)，包括奈瑟菌科(Neisseriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)及分枝桿菌屬等細(xì)菌的16S rDNA序列。其序列來(lái)自每一種細(xì)菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果，可免費(fèi)提供240種細(xì)菌的16S rDNA比對(duì)。④ SmartGene IDNS：2006年由瑞士SmartGene GmbH公司研發(fā)，有償使用。其序列來(lái)源于GenBank，也存在部分序列可靠性不高的問(wèn)題。因此，標(biāo)本中細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增、測(cè)序后，要選擇合適的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)進(jìn)行比對(duì)分析[30]。

5 結(jié)語(yǔ)

從鑒定的準(zhǔn)確率來(lái)看，建立在細(xì)菌分離株基礎(chǔ)上的16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序具有的優(yōu)勢(shì)毋庸置疑，因此被視為細(xì)菌鑒定與分類的“金標(biāo)準(zhǔn)”。如前文所述，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室對(duì)一些血培養(yǎng)標(biāo)本、抗生素治療后標(biāo)本的研究已證實(shí)這一點(diǎn)。但真正應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本的直接檢測(cè)還存在諸多問(wèn)題，如標(biāo)本污染如何克服、通用引物如何選擇、測(cè)序結(jié)果如何準(zhǔn)確判讀等。目前臨床標(biāo)本的細(xì)菌鑒定還主要依靠形態(tài)學(xué)、分離培養(yǎng)和生化檢測(cè)等常規(guī)方法及Vitek、RapID和API等全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，而細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序鑒定方法作為一種輔助手段，適合在一些常規(guī)方法難以鑒定的細(xì)菌、罕見的細(xì)菌、難以培養(yǎng)的細(xì)菌、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有描述的細(xì)菌及新的細(xì)菌種類分析等情況下使用。

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