腸道病毒71型感染所致手足口病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥研究中采用的細(xì)胞系和小鼠模型

劉巖，陳麗琴

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，呼和浩特 010059

手足口病是由腸道病毒引起的傳染病，多數(shù)溫和，具有自限性。主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱，手、足、臀部皮疹，皰疹性咽峽炎等，少數(shù)病例可發(fā)展為重癥，如腦炎、腦干腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫，遺留后遺癥甚至死亡[1]。目前公認(rèn)的導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥的病原體是腸道病毒71型 (enterovirus 71，EV71)。臨床資料顯示，EV71感染所致手足口病較其他腸道病毒進(jìn)展速度更快，可有高熱、肢體運(yùn)動失調(diào)、昏迷、抽搐等神經(jīng)系統(tǒng)損害及呼吸、循環(huán)功能受損表現(xiàn)，臨床癥狀與體征十分吻合[2]。

自1969年在美國加利福尼亞州中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患兒糞便中首次分離到EV71以來[3]，EV71所致手足口病在國內(nèi)外廣泛傳播，我國北京[4]、臺灣地區(qū)[5]、廣東[6]、遼寧[3]、山東[7]、安徽[8]等地，以及日本[9]、新加坡[10]、越南[11]、馬來西亞[12]、德國[13]等國均發(fā)生過較大規(guī)模流行。EV71有3個(gè)基因型別(A、B、C)，包括A1、A2，B1～B5和C1～C5亞型[9,11,13,14]。日本曾發(fā)現(xiàn)A1亞型，與20世紀(jì)70年代歐洲引起脊髓灰質(zhì)炎樣癱瘓的病毒基因型接近，隨后在1998～2003年的手足口病病例中分離到B5亞型[9]。2000年9～10月新加坡手足口病流行期間，在死亡病例陽性標(biāo)本中均檢測到EV71[10]。2005年在越南南部暴發(fā)手足口病病例中發(fā)現(xiàn)C5亞型[11]。2007年法國手足口病流行的致死性病原體屬C2亞型[15]。我國最多見的是C4亞型[8]。我國對2008年5月～2009年12月EV71感染所致1 065 000例手足口病病例統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，其中91.9%<5歲，發(fā)病高峰在1歲以下，男性多于女性；北京、天津、上海、浙江、海南為高發(fā)地區(qū)，4～8月為高發(fā)月份，且城市高于農(nóng)村[16]。

近年來手足口病暴發(fā)呈增多趨勢，重癥手足口病給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。目前對EV71致病機(jī)制的研究及藥物和疫苗的篩選仍處于實(shí)驗(yàn)階段，而適宜的體外細(xì)胞及動物模型是開展各種實(shí)驗(yàn)的前提。本文總結(jié)了近年來常用的細(xì)胞系和小鼠模型，以期為早日攻克手足口病提供一定的幫助。

1 體外細(xì)胞

1.1 腫瘤細(xì)胞

1.1.1RD細(xì)胞即人橫紋肌肉瘤細(xì)胞，常用于EV71的培養(yǎng)和分離。在提取單克隆抗體以區(qū)別臨床上感染病毒種類的實(shí)驗(yàn)中，RD細(xì)胞可作為EV71增殖的感染細(xì)胞[17]。另外，RD細(xì)胞對EV71高度易感，有研究者認(rèn)為此系其表面存在人清道夫受體B2(scavenger receptor B2，SCARB2)。Yamayoshi等[18]將RD細(xì)胞的染色體DNA轉(zhuǎn)染至不易感染EV71的小鼠L929細(xì)胞，得到2個(gè)攜帶人類基因的單克隆細(xì)胞系Ltr051和Ltr246。應(yīng)用人微陣列基因分析及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)擴(kuò)增轉(zhuǎn)化株的SCARB2等，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株穩(wěn)定表達(dá)人SCARB2。用EV71的亞型SK-EV006感染L-SCARB2細(xì)胞(Ltr051、Ltr246)和RD細(xì)胞，48 h后2種細(xì)胞即可出現(xiàn)病變；進(jìn)一步用EV71的亞型BrCr (基因型A)、Nagoya (基因型B)和Isehara (基因型C)感染L-SCARB2細(xì)胞，結(jié)果與RD細(xì)胞的易感性相似。這一結(jié)果表明，SCARB2可參與多種EV71亞型導(dǎo)致的手足口病。EV71對L-SCARB2細(xì)胞和RD細(xì)胞的感染可被SCARB2抗體以劑量依賴性方式抑制，證明SCARB2與EV71感染相關(guān)。RD細(xì)胞還可用于體外抗EV71藥物實(shí)驗(yàn)以評估藥效，利巴韋林和普拉康納利(pleconaril)均可有效提高EV71感染的RD細(xì)胞的存活能力，用藥細(xì)胞極少出現(xiàn)細(xì)胞病變[19]。

1.1.2SF268細(xì)胞即人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。由于EV71易侵犯膠質(zhì)細(xì)胞，參與感染細(xì)胞DNA斷裂、磷脂酰絲氨酸遷移等凋亡過程，SF268細(xì)胞常用于此方面的研究。Shih等[20]將SF268細(xì)胞作為易感細(xì)胞，應(yīng)用紫外線滅活EV71、RNA合成抑制劑及氯喹阻礙病毒脫衣殼等干預(yù)凋亡各相關(guān)階段，觀察到凋亡的發(fā)生繼發(fā)于病毒吸附、入胞、脫衣殼等過程之后，感染細(xì)胞的凋亡主要在病毒蛋白合成和病毒復(fù)制階段進(jìn)行，病毒蛋白合成對凋亡的啟動極其重要。

1.1.3SK-N-MC和SK-N-SH細(xì)胞即人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。Chang等[21]用EV71感染SK-N-MC、SF268、RD、Vero等細(xì)胞，研究神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞被感染后的凋亡通路。EV71可導(dǎo)致細(xì)胞DNA斷裂、磷脂酰絲氨酸遷移，凋亡前細(xì)胞色素C從線粒體流入細(xì)胞質(zhì)，啟動caspase-9的活化過程，通過線粒體途徑和caspase-9途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡；而caspase-8的活化只在非神經(jīng)細(xì)胞中存在。SK-N-SH細(xì)胞系曾作為EV71的感染細(xì)胞用于牛乳鐵傳遞蛋白的抗EV71測試，該乳鐵蛋白可通過與EV71和宿主細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)I型干擾素、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)等產(chǎn)生，抑制EV71感染，是治療EV71所致手足口病的藥物之一[22]。

1.1.4Caco-2細(xì)胞即人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞。由于其起源于人腸細(xì)胞，在特殊培養(yǎng)條件下可分化為腸上皮細(xì)胞，且細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)較為成熟，因此廣泛應(yīng)用于體外實(shí)驗(yàn)研究。常與SK-N-SH細(xì)胞共同用于EV71的培養(yǎng)、分離和感染。有報(bào)道，在SK-N-SH和Caco-2細(xì)胞接種EV71的4643和MP4亞型，比較2種亞型在不同細(xì)胞中的生長速度，再將培養(yǎng)的病毒接種新生小鼠，從而選擇小鼠敏感的EV71亞型用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染研究[23]。

1.1.5RD-18S細(xì)胞即克隆的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。在手足口病流行地區(qū)，往往存在多種類型病毒，需用多種細(xì)胞如RD-18S、Vero、 HeLa、GL-37等作為培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖，并用多種技術(shù)如中和抗體測定、反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcriptase-PCR，RT-PCR)擴(kuò)增、核苷酸序列分析等測定病毒類型[24]。

1.1.6HeLa細(xì)胞即人宮頸癌細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)周期長且特異性較低，短期內(nèi)難以用于臨床診斷，因此RT-PCR是目前廣泛采用的手足口病病毒基因擴(kuò)增技術(shù)，在應(yīng)用RT-PCR前需將臨床提取的帶有病毒的樣本接種于易感細(xì)胞進(jìn)行增殖，HeLa細(xì)胞和RD細(xì)胞較為常用[10]。

1.1.7DLD-1腸細(xì)胞即人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞。該細(xì)胞表面存在的唾液酸聚糖(sialylated glycan)是EV71的受體之一，與EV71結(jié)合能感染細(xì)胞，而唾液酸酶能抑制EV71的感染與復(fù)制。天然存在于人乳中的唾液酸偶聯(lián)的抑制性多糖對DLD-1腸細(xì)胞的EV71感染也有明顯降低作用，這為母乳喂養(yǎng)預(yù)防EV71感染提供了客觀證據(jù)[25]。

1.2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

1.2.13T3-SCARB2細(xì)胞隨著SCARB2的發(fā)現(xiàn)，近年來有研究者將人SCARB2基因整合入NTH3T3小鼠成纖維細(xì)胞，獲得SCARB2的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。Lin等[26]用EV71感染包括3T3-SCARB2細(xì)胞在內(nèi)的3種易感細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EV71衣殼蛋白的表達(dá)程度在3T3-SCARB2細(xì)胞最高，在RD細(xì)胞居中，在Vero細(xì)胞最低，從而證明了SCARB2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的易感性。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格蛋白依賴的胞吞作用是EV71入胞的通路，這一通路需在pH值較低的內(nèi)涵體酸化環(huán)境中進(jìn)行。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)可干擾EV71入胞，這為siRNA成為治療EV71感染的候選方法之一提供了證據(jù)。

1.2.2Ltr051細(xì)胞即SCARB2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。用RD細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染小鼠L929細(xì)胞，獲得攜帶人SCARB2基因的細(xì)胞系Ltr051和Ltr246。EV71感染 Ltr051、Ltr246和RD細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)證明，Ltr051細(xì)胞較Ltr246細(xì)胞更易感，高效表達(dá)人SCARB2基因。研究表明，Ltr051和RD細(xì)胞對EV71具有相似的易感性[18]。這一研究成功建立了體外SCARB2動物細(xì)胞模型，從而使Ltr051鼠細(xì)胞能模擬人類細(xì)胞用于EV71感染機(jī)制的研究。

1.3 其他種類細(xì)胞

1.3.1Vero細(xì)胞即非洲綠猴腎細(xì)胞。常將EV71接種于Vero細(xì)胞增殖，提取的EV71滅活后注入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)進(jìn)行疫苗研究[27,28]。另外，在EV71毒力和抗原性等研究中，Vero細(xì)胞可用于病毒RNA轉(zhuǎn)染載體及從感染動物組織中分離病毒[29]。將EV71 C4亞型Hn2在Vero細(xì)胞中增殖，滅活后接種實(shí)驗(yàn)動物，行單克隆抗體測定，對制備抗EV71的免疫制劑有重要意義[30]。

1.3.2THP-1細(xì)胞即人單核細(xì)胞。Han[31]等將不同濃度的靜脈注射丙種球蛋白(intravenous immunogloblin，IVIG)與EV71混合孵育后感染THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高濃度IVIG抑制EV71感染，而低濃度IVIG增加感染。這種劑量對感染程度的影響支持了抗體依賴性增強(qiáng)(antibody-dependent enhancement，ADE)假說，可協(xié)助指導(dǎo)抗EV71藥物的制備。

1.3.3JurkatT細(xì)胞即人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞株。近年來，P選擇素糖蛋白配體 1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1)與SCARB2成為備受關(guān)注的EV71細(xì)胞受體，因?yàn)镴urkat T細(xì)胞表面存在PSGL-1受體，與EV71結(jié)合能進(jìn)入細(xì)胞，可用于研究PSGL-1介導(dǎo)的EV71感染[32,33]。

1.3.4GL-37細(xì)胞即克隆的非洲綠猴腎細(xì)胞。曾用于甲型肝炎病毒的分離。在應(yīng)用Vero細(xì)胞難以分離EV71的手足口病流行地區(qū)，GL-37細(xì)胞可用于病毒培養(yǎng)[24]。

1.3.5巨噬細(xì)胞最近研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞對EV71具有吞噬、抑制復(fù)制等作用。將取自美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research，ICR)成年小鼠的巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)，接種EV71，結(jié)果顯示病毒滴度逐漸下降，RNA復(fù)制減緩，而接種EV71的RD細(xì)胞中病毒滴度明顯上升。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，病毒抗原主要集中分布于巨噬細(xì)胞的溶酶體[34]，這一發(fā)現(xiàn)使人們對EV71感染后機(jī)體的免疫機(jī)制有了進(jìn)一步了解。

2 小鼠模型

2.1 新生小鼠

有研究表明，小鼠對EV71的敏感性隨年齡增長而降低，甚至消失。1日齡小鼠對EV71敏感性最高[35]，因此新生幼鼠應(yīng)用得最多，且常用于神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥實(shí)驗(yàn)。Chen等[36]用1日齡ICR小鼠建立口腔EV71感染模型，動態(tài)觀察其VP1抗原在小鼠組織及器官中分布的變化。感染6 h可在腸組織檢出，24 h在胸段脊髓觀察到，50 h病毒上行至頸髓，78 h至腦干，表明EV71在幼鼠中的感染是沿神經(jīng)系統(tǒng)路徑擴(kuò)散的。不同種系的幼鼠感染后亦較快出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如用1日齡昆明小鼠建立的二次感染模型，初次感染無毒力病毒后的無癥狀幼鼠在第2次感染后可并發(fā)肢體癱瘓、角弓反張等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，死亡率明顯升高[30]。另外，小鼠對EV71亞型MP4敏感，給1日齡ICR小鼠腹腔注射半數(shù)致死量MP4和EV71另一亞型4643，感染MP4的小鼠死亡速度快，并引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[23]。滅活疫苗實(shí)驗(yàn)中，給2日齡BALB/c小鼠腹腔注射半數(shù)致死量EV71亞型Hn2，24 h后再以不同稀釋濃度的滅活EV71-Hn2制備的疫苗給予免疫，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生多種單克隆抗體，監(jiān)測小鼠的存活率并進(jìn)行體外中和抗體測定，從而篩選出對小鼠保護(hù)作用最強(qiáng)的4E8單克隆抗體[30]。

2.2 成年小鼠

已有用成年雌性BALB/c小鼠進(jìn)行EV71 VP1基因疫苗[37]和EV71滅活疫苗實(shí)驗(yàn)成功的報(bào)道[30]。最近發(fā)現(xiàn)，用重組EV71 C4亞型的病毒樣微粒(virus-like particle，VLP)被動免疫成年母鼠，可激發(fā)免疫應(yīng)答并誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，使新生幼鼠免受EV71致死性感染[38]。將EV71 VP1蛋白在畢赤酵母表達(dá)，獲得的重組VP1可有效誘導(dǎo) BALB/c 小鼠產(chǎn)生抗VP1抗體，將其產(chǎn)生的抗血清接種于新生小鼠能產(chǎn)生保護(hù)效能。該重組VP1具有較高的免疫原性并能使小鼠抗病毒能力增強(qiáng)，是候選疫苗之一[39]。類似地，以長雙歧桿菌為載體也獲得重組VP1，通過口腔黏膜免疫6周齡雌性 BALB/c 小鼠，小鼠對EV71的免疫應(yīng)答明顯提高并產(chǎn)生抗體；在小鼠懷孕后繼續(xù)接種該疫苗，可降低新生小鼠的感染率[40]。這類經(jīng)口腔給藥的疫苗避免了注射帶來的痛苦，是一個(gè)新的接種途徑。

2.3 免疫缺陷小鼠

免疫缺陷小鼠，如AG129小鼠，是一種缺乏Ⅰ型和Ⅱ型干擾素受體的小鼠，對非小鼠適應(yīng)性EV71易感。有研究報(bào)道，將非小鼠適應(yīng)性EV71通過腹腔注射或口腔感染2周齡AG129小鼠，結(jié)果均出現(xiàn)致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，這可用于EV71感染發(fā)病機(jī)制研究及疫苗、藥物實(shí)驗(yàn)[41]。最近有人用A129小鼠(缺乏α和β 干擾素受體)和AG129小鼠(缺乏α、β和γ 干擾素受體)篩選小鼠敏感的EV71 B2亞型，結(jié)果AG129小鼠在出現(xiàn)四肢癱瘓、眼刺激、平衡喪失等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后死亡，而A129小鼠對這種EV71具有抗病能力，提示 γ干擾素受體似乎對EV71有一定抵抗力。給AG129小鼠注射不同稀釋濃度的滅活EV71疫苗，小鼠產(chǎn)生不同程度的抗感染保護(hù)作用并存活[28]。該實(shí)驗(yàn)雖獲得預(yù)期結(jié)果，但這類小鼠模型并不能較完善地模擬人類EV71感染的臨床表現(xiàn)，因此結(jié)果不能直接用于人類。

2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠

已成功培育出PSGL-1轉(zhuǎn)基因小鼠，可用于探討EV71受體PSGL-1是否在小鼠中起作用從而復(fù)制與人類相似的疾病，以及是否對EV71感染有促進(jìn)作用。結(jié)果表明，PSGL-1轉(zhuǎn)基因小鼠感染EV71后，疾病的嚴(yán)重程度并沒有增加[42]。Yamayoshi等[43]通過實(shí)驗(yàn)鑒定了人SCARB2與EV71結(jié)合的功能區(qū)域，認(rèn)為SCARB2表面142～204位氨基酸(對應(yīng)的編碼區(qū)是外顯子4)可能是其與病毒結(jié)合的核心區(qū)域，曾設(shè)想將人SCARB2外顯子4替換入小鼠的相應(yīng)區(qū)域，建立一個(gè)新的小鼠易感模型。受此啟發(fā)，最近有研究者將攜帶人SCARB2基因的質(zhì)粒導(dǎo)入C57BL/6小鼠胚胎，建立人SCARB2轉(zhuǎn)基因小鼠。研究者對此類小鼠進(jìn)行一系列研究：給新生幼鼠皮下接種E59和N2838(均為EV71 B4亞型)，小鼠出現(xiàn)皮疹病損，與人類幼兒所患手足口病的特征性皮疹一致，感染6 d后出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)樣疾??；而年齡稍長的小鼠(2周齡以上)感染后疾病較輕并最終痊愈，這與人類手足口病隨年齡增長而下降一致。用低劑量5746(EV71 C2亞型)感染轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果全部死亡；中劑量5746感染后，轉(zhuǎn)基因鼠較非轉(zhuǎn)基因鼠死亡更迅速。用N3340(EV71 C4亞型)感染新生小鼠，也導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病并死亡，而對照組非轉(zhuǎn)基因小鼠對N3340敏感性較低[44]。

3 討論

為探索EV71的致病性及防治措施，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究。近年來有研究者認(rèn)為，EV71是通過與受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞的，由于EV71型別不同，受體也有多種，目前發(fā)現(xiàn)的受體主要有SCARB2、PSGL-1、唾液酸聚糖、硫酸乙酰肝素黏多糖[25,32,45,46]。通過阻斷EV71通過受體入胞的通路，可降低感染。由于囊泡運(yùn)輸和成熟、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌動蛋白聚合等過程是EV71進(jìn)入細(xì)胞所必需的，所以可通過沉默囊泡和內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)基因等方法降低EV71的感染力[47]。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)EV71染色體編碼RNA依賴的RNA聚合酶，此種聚合酶是病毒復(fù)制的關(guān)鍵，也是研制抗病毒藥物的靶點(diǎn)之一[48]。

目前針對EV71的候選藥物有牛乳鐵傳遞蛋白[22]、Ⅰ型干擾素[49]、普拉康納利[19]、siRNA[26]等，疫苗種類主要有滅活疫苗[30]、重組EV71 VP1殼粒蛋白[39]、重組EV71 VLP[38]等。這些藥物和疫苗在體外細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中均顯示了良好效果。近年來EV71滅活疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，受試者接種后中和抗體增高、T細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)，有顯著的免疫效應(yīng)[50]。然而應(yīng)用藥物和疫苗的對象將是廣大兒童，所以必須考慮藥物和疫苗的安全性及遠(yuǎn)期作用，因此在與EV71所致手足口病的斗爭中還有漫長的路要走。

[1] Wang SM, Liu CC. Enterovirus 71:epidemiology, pathogenesis and management [J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2009, 7 (6):735-742.

[2] Xu W, Liu CF, Yan L, Li JJ, Wang LJ, Qi Y, Cheng RB，Xiong XY. Distribution of enteroviruses in hospitalized children with hand, foot and mouth disease and relationship between pathogens and nervous system complications [J]. Virol J, 2012, 9: 8.

[3] Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH.An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system [J].J Infect Dis, 1974, 129 (3):304-309.

[4] Cao ZD, Zeng DJ, Wang QY, Zheng XL, Wang FY.An epidemiological analysis of the Beijing 2008 hand-foot-mouth epidemic [J]. Chin Sci Bull, 2010, 55(12): 1142-1149.

[5] Wang SM, Ho TS, Lin HC, Lei HY, Wang JR, Liu CC. Reemerging of enterovirus 71 in Taiwan: the age impact on disease severity [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012, 31(6): 1219-1224.

[6] De W, Changwen K, Wei L, Monagin C, Jin Y, Cong M, Hanri Z, Jun S. A large outbreak of hand，foot and mouth disease caused by EV71 and CAV16 in Guangdong，China，2009 [J].Arch Virol, 2011, 156(6): 945-953.

[7] Zhang Y, Tan XJ, Wang HY, Yan DM, Zhu SL, Wang DY, Ji F, Wang XJ, Gao YJ, Chen L, An HQ, Li DX, Wang SW, Xu AQ, Wang ZJ, Xu WB. An outbreak of hand, foot, and mouth disease associated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China [J]. J Clin Virol，2009. 44(4): 262-267.

[8] Zhang Y, Zhu Z, Yang W, Ren J, Tan X, Wang Y, Mao N, Xu S, Zhu S, Cui A, Zhang Y, Yan D, Li Q, Dong X, Zhang J, Zhao Y, Wan J, Feng Z, Sun J, Wang S, Li D, Xu W. An emerging recombinant human enterovirus 71 responsible for the 2008 outbreak of hand foot and mouth disease in Fuyang City of China [J]. Virol J, 2010, 7：94.

[9] Mizuta K, Abiko C, Murata T, Matsuzaki Y, Itagaki T, Sanjoh K, Sakamoto M, Hongo S, Murayama S, Hayasaka K. Frequent importation of enterovirus 71 from surrounding countries into the local community of Yamagata, Japan, between 1998 and 2003 [J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(12): 6171-6175.

[10] Singh S, Chow VT, Phoon MC, Chan KP, Poh CL.Direct detection of enterovirus 71 (EV71) in clinical specimens from a hand, foot, and mouth disease outbreak in Singapore by reverse transcription-PCR with universal enterovirus and EV71-specific primers [J].J Clin Microbiol, 2002, 40(8): 2823-2827.

[11] Tu PV, Thao NT, Perera D, Huu TK, Tien NT, Thuong TC, How OM, Cardosa MJ, McMinn PC. Epidemiologic and virologic investigation of hand, foot, and mouth disease,southern Vietnam, 2005 [J]. Emerg Infect Dis, 2007, 13(11): 1733-1741.

[12] Chan LG，Parashar UD，Lye MS，Ong FG，Zaki SR，Alexander JP，Ho KK，Han LL，Pallansch MA，Suleiman AB，Jegathesan M, Anderson LJ. Deaths of children during an outbreak of hand, foot, and mouth disease in Sarawak，Malaysia：clinical and pathological characteristics of the disease.For the Outbreak Study Group [J]. Clin Infect Dis, 2000, 31(3)：678-683.

[13] Rabenau HF, Richter M, Doerr HW. Hand foot and mouth disease：seroprevalence of coxsackie A16 and enterovirus 71 in Germany [J]. Med Microbiol Immunol, 2010, 199(1)：45-51.

[14] Munemura T, Saikusa M, Kawakami C, Shimizu H, Oseto M, Hagiwara A, Kimura H, Miyamura T.Genetic diversity of enterovirus 71 isolated from cases of hand, foot and mouth disease in Yokohama City between 1982 and 2000[J].Arch Virol，2003，148(2):253-263.

[15] Vallet S, Legrand Quillien MC, Dailland T, Podeur G, Gouriou S, Schuffenecker I, Payan C, Marcorelles P. Fatal case of enterovirus 71 infection, France, 2007 [J].Emerg Infect Dis, 2009, 15(11): 1837-1840.

[16] Zhu Q，Hao Y，Ma J，Yu S，Wang Y.Surveillance of hand, foot, and mouth disease in Mainland China (2008-2009) [J].Biomed Environ Sci, 2011, 24(4): 349-356.

[17] Kiener TK, Jia Q, Lim XF, He F, Meng T, Chow VT, Kwang J. Characterization and specificity of the linear epitope of the enterovirus 71 VP2 protein [J]. Virol J, 2012, 9: 55.

[18] Yamayoshi S, Yamashita Y, Li J, Hanagata N, Minowa T, Takemura T, Koike S. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71 [J]. Nat Med, 2009, 15(7): 798-801.

[19] Zhang G, Zhou F, Gu B, Ding C, Feng D, Xie F, Wang J, Zhang C, Cao Q, Deng Y, Hu W, Yao K. In vitro and in vivo evaluation of ribavirin and pleconaril antiviral activity against enterovirus 71 infection [J]. Arch Virol, 2012, 157(4)：669-679.

[20] Shih SR, Weng KF, Stollar V, Li ML. Viral protein synthesis is required for enterovirus 71 to induce apoptosis in human glioblastoma cells [J].J Neurovirol, 2008, 14(1): 53-61.

[21] Chang SC, Lin JY, Lo LY, Li ML, Shih SR. Diverse apoptotic pathways in enterovirus 71-infected cells [J].J Neurovirol, 2004, 10(6): 338-349.

[22] Weng TY, Chen LC, Shyu HW, Chen SH, Wang JR, Yu CK, Lei HY, Yeh TM. Lactoferrin inhibits enterovirus 71 infection by binding to VP1 protein and host cells [J]. Antiviral Res, 2005, 67(1):31-37.

[23] Wang YF, Chou CT, Lei HY, Liu CC, Wang SM, Yan JJ, Su IJ, Wang JR, Yeh TM, Chen SH, Yu CK. A mouse-adapted enterovirus 71 strain causes neurological disease in mice after oral infection [J]. Virol J, 2004, 78(15): 7916-7924.

[24] Fjimoto T, Chikahira M, Yoshida S, Ebira H, Hasegawa A, Totsuka A, Nishio O. Outbreak of central nervous system disease associated with hand, foot, and mouth disease in Japan during the summer of 2000: detection and molecular epidemiology of enterovirus 71 [J]. Microbiol Immunol, 2002, 46(9): 621-627.

[25] Yang B, Chuang H, Yang KD. Sialylated glycans as receptor and inhibitor of enterovirus 71 infection to DLD-1 intestinal cells [J] . Virol J, 2009, 6:141.

[26] Lin YW, Lin HY, Tsou YL, Chitra E, Hsiao KN, Shao HY, Liu CC, Sia C, Chong P, Chow YH. Human SCARB2-mediated entry and endocytosis of EV71 [J]. PLoS One, 2012, 7(1): e30507.

[27] Liang Y, Zhou X, Yang E, Pu J, Che Y, Wang J, Ma N, Liu L, Ding D, Tang D, Sheng D, Yang L, Zhao H, Dong C, Li Q. Analysis of the Th1/Th2 reaction in the immune response induced by EV71 inactivated vaccine in neonatal rhesus monkeys [J]. J Clin Immunol, 2012, 32(5): 1048-1058.

[28] Caine EA, Partidos CD, Santangelo JD, Osorio JE. Adaptation of enterovirus 71 to adult interferon deficient mice [J]. PLoS One, 2013, 8(3): e59501.

[29] Arita M, Nagata N, Iwata N, Ami Y, Suzaki Y, Mizuta K, Iwasaki T, Sata T, Wakita T, Shimizu H.An attenuated strain of enterovirus 71 belonging to genotype A showed a broad spectrum of antigenicity with attenuated neurovirulence in cynomolgus monkeys [J]. J Virol, 2007, 81(17): 9386-9395.

[30] Chang GH, Luo YJ, Wu XY, Si BY, Lin L, Zhu QY. Monoclonal antibody induced with inactived EV71-Hn2 virus protects mice against lethal EV71-Hn2 virus infection [J]. Virol J, 2010, 7: 106.

[31] Han JF, Cao RY, Deng YQ, Tian X, Jiang T, Qin ED, Qin CF. Antibody dependent enhancement infection of enterovirus 71 in vitro and in vivo [J]. Virol J, 2011, 8: 106.

[32] Nishimura Y, Shimojima M, Tano Y, Miyamura T, Wakita T, Shimizu H. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71 [J]. Nat Med, 2009,15(7): 794-797.

[33] Nishimura Y, Wakita T, Shimizu H. Tyrosine sulfation of the amino terminus of PSGL-1 is critical for enterovirus 71 infection [J].PLoS Pathog, 2010, 6(11): e1001174.

[34] Liu J, Li X, Fan X, Ma C, Qin C, Zhang L. Adoptive transfer of macrophages from adult mice reduces mortality in mice infected with human enterovirus 71 [J]. Arch Virol, 2013, 158(2):387-397.

[35] Yu CK, Chen CC, Chen CL, Wang JR, Liu CC, Yan JJ, Su IJ. Neutralizing antibody provided protection against enterovirus type 71 lethal challenge in neonatal mice [J]. J Biomed Sci, 2000, 7(6): 523-528.

[36] Chen YC, Yu CK, Wang YF, Liu CC, Su IJ, Lei HY. A murine oral enterovirus 71 infection model with central nervous system involvement [J]. J Gen Virol, 2004, 85(Pt 1): 69-77.

[37] Tung WS, Bakar SA, Sekawi Z, Rosli R. DNA vaccine constructs against enterovirus 71 elicit immune response in mice [J]. Genet Vaccines Ther, 2007, 5: 6.

[38] Ku Z, Ye X, Huang X, Cai Y, Liu Q, Li Y, Su Z, Huang Z. Neutralizing antibodies induced by recombinant virus-like particles of enterovirus 71 genotype C4 inhibit infection at pre- and post-attachment steps [J]. PLoS One, 2013, 8(2): e57601.

[39] Wang M. Jiang S. Wang Y. Recombinant VP1 protein expressed in Pichia pastoris induces protective immune responses against EV71 in mice [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 430(1): 387-393.

[40] Yu Z, Huang Z, Sao C, Huang Y, Zhang F, Ma G, Chen Z, Zeng Z, Qiwen D, Zeng W. Oral immunization of mice using Bifidobacterium longum expressing VP1 protein from enterovirus 71 [J]. Arch Virol, 2013, 158(5): 1071-1077.

[41] Khong WX, Yan B, Yeo H, Tan EL, Lee JJ, Ng JK, Chow VT, Alonso S. A non-mouse-adapted enterovirus 71 (EV71) strain exhibits neurotropism, causing neurological manifestations in a novel mouse model of EV71 infection [J]. J Virol, 2012, 86(4): 2121-2131.

[42] Liu J, Dong W, Quan X, Ma C, Qin C, Zhang L. Transgenic expression of human P-selectin glycoprotein ligand-1 is not sufficient for enterovirus 71 infection in mice [J]. Arch Virol, 2012, 157(3): 539-543.

[43] Yamayoshi S, Koike S. Identification of a human SCARB2 region that is important for enterovirus 71 binding and infection [J]. J Virol, 2011, 85(10): 4937-4946.

[44] Lin YW, Yu SL, Shao HY, Lin HY, Liu CC, Hsiao KN, Chitra E, Tsou YL, Chang HW, Sia C, Chong P, Chow YH. Human SCARB2 transgenic mice as an infectious animal model for enterovirus 71 [J]. PLoS One, 2013, 8(2): e57591.

[45] Yamayoshi S, Fujii K ,Koike S. Scavenger receptor B2 as a receptor for hand, foot, and mouth disease and severe neurological diseases [J]. Front Microbiol, 2012, 3: 32.

[46] Tan CW, Poh CL, Sam IC, Chan YF. Enterovirus 71 uses cell surface heparan sulfate glycosaminoglycan as an attachment receptor [J]. J Virol, 2013, 87(1): 611-620.

[47] Hussain KM, Leong KL, Ng MM, Chu JJ. The essential role of clathrin-mediated endocytosis in the infectious entry of human enterovirus 71 [J].J Biol Chem, 2011, 286(1): 309-321.

[48] Wu Y, Lou Z, Miao Y, Yu Y, Dong H, Peng W, Bartlam M, Li X, Rao Z. Structures of EV71 RNA-dependent RNA polymerase in complex with substrate and analogue provide a drug target against the hand-foot-and-mouth disease pandemic in China [J]. Protein Cell, 2010, 1(5): 491-500.

[49] Liu ML, Lee YP, Wang YF, Lei HY, Liu CC, Wang SM, Su IJ,Wang JR, Yeh TM, Chen SH, Yu CK. Type I interferons protect mice against enterovirus 71 infection [J]. J Gen Virol, 2005, 86 (Pt 12):3263-3269.

[50] Liu L, Zhang Y, Wang J, Zhao H, Jiang L, Che Y, Shi H, Li R, Mo Z, Huang T, Liang Z, Mao Q, Wang L, Dong C, Liao Y, Guo L, Yang E, Pu J, Yue L, Zhou Z, Li Q. Study of the integrated immune response induced by an inactivated EV71 vaccine [J]. PLoS One, 2013, 8(1): e54451.