米淀粉為基質(zhì)的脂肪替代品中麥芽糊精結(jié)構(gòu)研究

楊玉玲 游 遠(yuǎn) 陳銀基 馬 云

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院糧食儲運國家工程實驗室，南京 210046）

目前世界上有40余種淀粉為基質(zhì)的脂肪替代品商品，這類脂肪替代品的制備方式通常分為兩類。一類是通過對原淀粉進(jìn)行交聯(lián)、取代等改性方式制得的，其主要成分是淀粉和改性淀粉；另一類是通過對原淀粉進(jìn)行輕度水解制得的，主要成分是DE值為2～6的麥芽糊精［1－2］。米或米淀粉為基質(zhì)的脂肪替代品是利用高溫α－淀粉酶對米粉或米淀粉進(jìn)行輕度水解獲到的，其DE值在2～3之間。這種脂肪替代品能模擬脂肪的根本原因在于其最主要成分麥芽糊精能形成特異性凝膠［3－4］。此脂肪替代品的凝膠特性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是由直鏈麥芽糊精與支鏈麥芽糊精的外鏈相互作用形成的，如果二者的長度很短，就不能形成凝膠，因此研究脂肪替代品中麥芽糊精分子的結(jié)構(gòu)具有重要意義。麥芽糊精分子的結(jié)構(gòu)參數(shù)包括直鏈麥芽糊精分子的鏈長，支鏈麥芽糊精分子的A鏈與B鏈的比值、內(nèi)鏈長和外鏈長［5］。支鏈麥芽糊精分子的A鏈?zhǔn)侵敢赃€原性末端通過α－1，6糖苷鍵結(jié)合到另一條鏈上而自己不被結(jié)合的鏈；B鏈?zhǔn)侵附Y(jié)合到別的鏈上，同時又被別的鏈結(jié)合的鏈；C鏈?zhǔn)蔷哂幸粋€還原性末端的鏈。在一個支鏈麥芽糊精分子中只有一條C鏈。外鏈（ECL）是指非還原性末端至最靠近外側(cè)分支點的一段鏈；內(nèi)鏈（ICL）是指相鄰兩個α－1，6糖苷鍵為分支點的一段鏈。

食品體系中常見的凝膠有3種類型，即通過共價交聯(lián)形成聚合物凝膠、通過微晶形成聚合物凝膠和通過顆粒堆積形成顆粒凝膠。通常認(rèn)為淀粉凝膠是通過微晶區(qū)域起連接作用形成的［6］，脂肪替代品中麥芽糊精在組成上與淀粉相同，在結(jié)構(gòu)上與淀粉相似，但鏈長變短，能否形成微晶結(jié)構(gòu)與其結(jié)構(gòu)參數(shù)一樣在國內(nèi)外均未見報導(dǎo)。因此，鑒于米和米淀粉為基質(zhì)脂肪替代品的制備方法和凝膠特性已有報道［3，7］，本試驗重點研究米淀粉為基質(zhì)脂肪替代品中支鏈糊精的精細(xì)結(jié)構(gòu)，并研究脂肪替代品的晶體結(jié)構(gòu)，以期對這類脂肪替代品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料與設(shè)備

1．1．1 材料

米淀粉（水分13．3%，淀粉 85．9%，脂肪 0．1%，蛋白質(zhì)0．12%）：實驗室自制［3］；高溫 α－淀粉酶：無錫杰能科生物技術(shù)有限公司；β－淀粉酶［EC3．2．1．2］（Type1－B）、異淀粉酶［EC3．2．1．68］、普魯蘭酶［EC3．2．1．41］（Type1－B）：Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1．1．2 儀器

QZ－5型高速噴霧干燥機：錫山林洲干燥機廠；YJ501型超級恒溫水浴：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Allegra 64 R型高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾有限公司；Dmar／ШB型X－射線衍射儀：日本理學(xué)公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 脂肪替代品的制備［3］

米淀粉140 g→調(diào)漿→調(diào)pH 6．0～6．5→調(diào)漿液濃度20%→90℃下糊化→加α－淀粉酶→水解至確定DE值（2、3、4）→滅酶→中和→過濾→噴霧干燥→包裝保存。

1．2．2 還原糖含量和總糖含量的測定

還原糖含量用直接滴定法測定，總糖含量用苯酚硫酸法測定［8］。脂肪替代品的DE值為樣品中還原糖含量占總糖含量的百分?jǐn)?shù)。

1．2．3 脂肪替代品分子結(jié)構(gòu)參數(shù)的測定

1．2．3．1 β－限制糊精的制備［5，9］

稱取1．0 g脂肪替代品分散于50 mL濃度為0．02 mol／L，pH 4．8的醋酸緩沖液，加入 β－淀粉酶（5 000 U），液面以2滴甲苯覆蓋以防止微生物生長，在37℃下水浴條件下進(jìn)行酶反應(yīng)。在反應(yīng)過程中不斷檢測體系的還原能力，直到為恒定值時（反應(yīng)時間需要30 h），將反應(yīng)液充分煮沸20 min滅酶，加3倍體積的甲醇沉淀，冰浴30 min后離心（6 000 r／min、20 min），棄去上清液，加75%的甲醇反復(fù)洗滌至離心后的上清液中不含麥芽糖（需要3次洗滌），再經(jīng)過冷凍干燥，得β－限制糊精。

1．2．3．2 支鏈糊精中A鏈與B鏈比和內(nèi)鏈長度的測定［10－13］

稱取β－限制糊精100 mg，以醋酸緩沖液（0．02 mol／L、pH 4．8）溶解并定容至 10 mL，經(jīng)標(biāo)定得到其真實濃度為7．652 mg／mL，取一定量的上述溶液，分別用異淀粉酶和普魯蘭酶進(jìn)行脫支水解后，計算出A鏈與B鏈比。

異淀粉酶脫支水解：取100μL上述β－限制糊精溶液，加入適量異淀粉酶和醋酸緩沖液使總體積達(dá)到1 mL，37℃水浴中保溫水解24 h，煮沸20 min滅酶后測定還原能力，此還原能力與A鏈和B鏈脫支產(chǎn)生的還原能力之間符合下列關(guān)系：

式中：I為異淀粉酶脫支水解β－限制糊精產(chǎn)生的還原能力，A為A鏈脫支產(chǎn)生的還原能力，B為B鏈脫支產(chǎn)生的還原能力。

以普魯蘭酶進(jìn)行脫支水解：取100μL濃度上述β－限制糊精溶液中加入適量異淀粉酶和醋酸緩沖液使總體積達(dá)到1 mL，37℃水浴中保溫水解24 h，煮沸20 min滅酶后測定其還原能力，此還原能力與A鏈和B鏈還原能力之間的關(guān)系符合公式（2）；支鏈麥芽糊精的內(nèi)鏈長度（ICL）與β－限制糊精中的總糖含量及普魯蘭酶脫支水解β－限制糊精產(chǎn)生的還原能力之間的關(guān)系符合公式（3）。

式中：J為普魯蘭酶脫支水解β－限制糊精產(chǎn)生的還原能力，A為A鏈脫支產(chǎn)生的還原能力，B為B鏈脫支產(chǎn)生的還原能力。

式中：ICL為支鏈麥芽糊精的內(nèi)鏈長度，S為β－限制糊精中的總糖含量（以葡萄糖計），J為普魯蘭酶脫支水解β－限制糊精產(chǎn)生的還原能力（以葡萄糖計）。

1．2．3．3 β－淀粉酶水解率的測定［10－13］

取1．0 g脂肪替代品分散于50 mL濃度為0．02 mol／L、pH 4．8的醋酸緩沖液，加入 β－淀粉酶（5 000 U）進(jìn)行反應(yīng)（同1．2．3．1）至滅酶，測定體系中的總糖含量與還原能力，同時以不加酶的樣品同樣處理作為對照，通過公式（4）可以計算β－淀粉酶水解率。

式中：P為脂肪替代品β－淀粉酶的水解率／%，n為體系的還原能力（以葡萄糖計），m為體系的總糖含量（以葡萄糖計）。

1．2．3．4 脂肪替代品中直鏈麥芽糊精鏈和支鏈麥芽糊精外鏈的平均鏈長計算

式中：L為平均鏈長；m為1．0 g脂肪替代品樣品中的總糖（以葡萄糖計）；P為β－淀粉酶的水解率；C為1．0 g脂肪替代品樣品中β－限制糊精經(jīng)普魯蘭酶水解后提供的還原能力（以葡萄糖計）；DE為脂肪替代品樣品的DE值。

1．2．4 脂肪替代品的晶體結(jié)構(gòu)測定

用X－射線衍射法進(jìn)行。測定條件：電壓35 kV、電流 20 mA、掃描速率 4°／min、測量范圍 2θ＝3～53°。

1．3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均為3個樣品重復(fù)，標(biāo)準(zhǔn)誤差等數(shù)據(jù)用SAS9．3軟件分析處理。

2 結(jié)果與討論

2．1 脂肪替代品中支鏈麥芽糊精分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)

2．1．1 異淀粉酶的脫支反應(yīng)

用異淀粉酶對脂肪替代品中的β－限制糊精進(jìn)行脫支反應(yīng)，測定水解液的還原能力，結(jié)果見表1。

從表1可見，當(dāng)異淀粉酶用量超過100 U時，體系的還原能力已經(jīng)達(dá)到最高值53．1μg（以葡萄糖計）。

表1 異淀粉酶用量與還原能力

在β－限制糊精α－1，6糖苷鍵上的葡萄糖單位為2個或3個，從統(tǒng)計學(xué)的角度看，殘留在β－限制糊精上的具有2個葡萄糖單位的A鏈片段數(shù)目和具3個葡萄糖單位的片段數(shù)目相等［10］。異淀粉酶能水解殘留在β－限制糊精上具有3個葡萄糖單位的A鏈片段的α－1，6糖苷鍵，但不能水解具有2個葡萄糖單位的A鏈片段的α－1，6糖苷鍵。因此，在體系水解完全時，異淀粉酶的還原能力在數(shù)值上等于A鏈脫支產(chǎn)生的還原能力的一半與B鏈脫支產(chǎn)生的還原能力之和。在給定反應(yīng)時間的條件下，隨異淀粉酶用量增加，水解的α－1，6糖苷鍵數(shù)目增加，被釋放出的還原端增加，因此體系的還原能力增加，直到β－限制糊精上B鏈全部脫支，具有3個葡萄糖單位的A鏈片段也全部脫支，還原能力達(dá)到最高值53．1μg（以葡萄糖計）后不再增加，表明體系水解已經(jīng)完全。

2．1．2 普魯蘭酶的脫支反應(yīng)

用普魯蘭酶對脂肪替代品中的β－限制糊精進(jìn)行脫支反應(yīng)，酶用量與水解液還原能力的關(guān)系見表2。

表2 普魯蘭酶用量與還原能力

從表2中可以確定，普魯蘭酶水解β－限制糊精的條件為：酶用量1．2 U，時間24 h。此時體系的最大還原能力為75．9μg（以葡萄糖計）。

普魯蘭酶能水解β－限制糊精上所有α－1，6糖苷鍵，因此體系水解完全時，普魯蘭酶作用后得到的還原能力為A鏈和B鏈脫支產(chǎn)生的還原能力之和［10］。在給定反應(yīng)時間的條件下，隨普魯蘭酶用量增加，水解的α－1，6糖苷鍵數(shù)目增加，體系還原能力也隨之增加，當(dāng)還原能力達(dá)到最高值75．9μg（以葡萄糖計）時，表示體系中α－1，6糖苷鍵全部水解。

2．1．3 支鏈麥芽糊精分子A鏈：B鏈比和內(nèi)鏈平均鏈長

將異淀粉酶水解β－限制糊精后釋放的還原能力53．1μg代入公式（1）得公式（6）；將普魯蘭酶作用后釋放的還原能力75．9μg代入公式（2）得公式（7）。

解上述二元一次方程得出A＝45．5μg，B＝30．5 μg。

由于一個A鏈和一個B鏈脫支時都僅能產(chǎn)生一個還原端，即產(chǎn)生的還原能力相同，因此A鏈和B鏈脫支產(chǎn)生的還原能力之比等于A鏈和B鏈數(shù)量之比，本試驗中 A鏈∶B鏈等于1．5∶1。

在本試驗中0．765 2 mgβ－限制糊精經(jīng)普魯蘭酶水解后得到的還原糖（以葡萄糖計）為75．9μg，通過公式（3）計算得到支鏈麥芽糊精分子內(nèi)鏈的平均鏈長為8．2個葡萄糖單位。

Marshell等［10］認(rèn)為一般支鏈淀粉的A鏈與B鏈比值介于1．5～2．6∶1之間，普通玉米支鏈淀粉的A鏈：B鏈為1．7。杜先鋒［14］測定了葛根支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)，其A鏈∶B鏈為1．2∶1，內(nèi)鏈平均鏈長為8。敖自華等［15］報道了銀杏支鏈淀粉的 A鏈∶B鏈為1．68∶1，內(nèi)鏈平均鏈長為7。米支鏈淀粉的A鏈與B鏈之比在1．3～1．5∶1范圍內(nèi)［16］，這與本試驗中脂肪替代品中支鏈糊精A鏈：B鏈結(jié)果相符。其原因在于當(dāng)米淀粉水解成脂肪替代品時，由于α－淀粉酶不能水解α－1，6糖苷鍵，所以支鏈淀粉和支鏈糊精中的β－限制糊精結(jié)構(gòu)是一致的，因此只要支鏈淀粉和支鏈糊精都來自同一種原料，二者的A鏈：B鏈比值和內(nèi)鏈平均鏈長就相同［6］。支鏈糊精形成凝膠不僅與相對分子質(zhì)量有關(guān)，還與其結(jié)構(gòu)參數(shù)如A鏈與B鏈的比值、內(nèi)鏈長度、外鏈長度等有關(guān)［12］。A鏈和B鏈的比值越高則形成凝膠的能力強，在聚合度不變時，內(nèi)鏈長度大會導(dǎo)致外鏈長度不足，凝膠能力變差［16］。

2．1．4 脂肪替代品中直鏈麥芽糊精鏈和支鏈麥芽糊精外鏈的平均鏈長

不同DE值的脂肪替代品經(jīng)β－淀粉酶水解后測定其水解率，并根據(jù)公式5分別計算其直鏈糊精鏈和支鏈糊精外鏈的平均鏈長，結(jié)果見表3。

表3 脂肪替代品的DE值與平均鏈長

從表3可見，脂肪替代品的DE值越高，β－淀粉酶水解率越低。這是因為α－淀粉酶和β－淀粉酶都作用于α－1，4糖苷鍵，被α－淀粉酶切開的糖苷鍵不再被β－淀粉酶作用，而產(chǎn)品DE值越高，被α－淀粉酶水解程度越大，因此β－淀粉酶水解率越低。

從表3還可見，隨著DE值增加，脂肪替代品中直鏈麥芽糊精分子鏈和支鏈麥芽糊精分子外鏈的平均鏈長變短，導(dǎo)致分子間相互纏結(jié)、相互作用減少，直接影響著脂肪替代品形成凝膠的能力。米和米淀粉為基質(zhì)的脂肪替代品DE值在2～3之間，DE4時只能形成很弱的凝膠，不適合作脂肪替代品［4］。因此，米淀粉為基質(zhì)脂肪替代品的β－淀粉酶水解率為62．3%～64．4%，平均鏈長為 12．6～15．6個葡萄糖單位。如果鏈長少于10．4個葡萄糖葡萄糖，則不適合作為脂肪替代品。目前，國內(nèi)外尚未見此方面的研究報道。

2．2 脂肪替代品的晶體結(jié)構(gòu)

在圖1中，米淀粉在17．7°和22．8°處分別出現(xiàn)了強度為5．0和 3．9的衍射峰，為 A型晶體［17－18］。米淀粉為基質(zhì)脂肪替代品在17．7°處也出現(xiàn)了強度很弱的衍射峰，但22．8°處不存在衍射峰，不屬于A型晶體；此外，脂肪替代品在13．2°和20．7°處出現(xiàn)了強度分別為6．70和4．27的衍射峰，這是V型晶體的衍射峰［19］，因此脂肪替代品中存在少量的V型晶體（圖2）。

圖1 米淀粉的X－射線衍射圖

圖2 米淀粉為基質(zhì)脂肪替代品的X－射線衍射圖

原料淀粉與脂肪替代品中晶體衍射峰不同說明二者的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。在用米淀粉制備脂肪替代品的過程中，糊化步驟導(dǎo)致了原淀粉中A型晶體消失。并且淀粉糊化后，直鏈淀粉從淀粉粒中瀝出，使脂肪有機會進(jìn)入直鏈淀粉螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部，并與之形成復(fù)合物。這種復(fù)合物能形成V型晶體衍射峰［17］。但脂肪替代品制備過程中，糊化的淀粉被輕度水解成麥芽糊精，脂肪替代品中的直鏈糊精能否有足夠的鏈長形成螺旋結(jié)構(gòu)并使脂肪陷在其中，到目前為止未見報道。但本研究發(fā)現(xiàn)脂肪替代品中含有少量V型晶體，說明脂肪替代品中的直鏈糊精還能形成螺旋結(jié)構(gòu)，并能與脂肪形成晶體，這對脂肪替代品形成凝膠可能是有利的。

3 結(jié)論

脂肪替代品中支鏈麥芽糊精分子的A鏈∶B鏈為1．5∶1；支鏈麥芽糊精分子的內(nèi)鏈平均鏈長為8．2個葡萄糖單位；DE值為2～3的脂肪替代品中直鏈麥芽糊精分子鏈和支鏈麥芽糊精分子外鏈的平均鏈長分別為12．6～15．6個葡萄糖單位。脂肪替代品中存在少量的V型晶體。

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