小劑量過氧化氫預處理對大鼠心肌缺血／再灌注損傷的保護作用*

馮潤荷，張金財，李小倩，孫海麗，劉 斌，趙蘊珍，唐向東，李 靜△

（1.天津醫(yī)學高等?？茖W校，天津300222；2.南開大學醫(yī)學院，天津300071）

急性心肌梗死是發(fā)達國家包括我國在內(nèi)的頭號殺手，在急性期導致猝死，在慢性期導致心力衰竭。雖然早期冠狀動脈內(nèi)支架置入恢復血液循環(huán)能大大改善患者的預后，但再灌注損傷（reperfusion injury，RI）導致的心律失常與心功能損害仍缺乏滿意的防治措施。眾多資料表明，心肌缺血之前若給予短暫多次缺血處理，可以明顯減輕接下來的長期缺血／再灌注損傷，此即著名的缺血預適應現(xiàn)象（ischemic preconditioning，IPC）。近來還發(fā)現(xiàn)，IPC可以在缺血后誘導（缺血后適應），甚至在心臟以外器官如下肢來遠程誘導（遠程預適應）［1］。深入研究IPC的發(fā)生機制有助于設計新奇的心肌保護（cardioprotection）措施，切實降低急性心肌梗死的死亡率。

然而，關于缺血預適應的心臟保護機制的認識仍然很模糊，其中，預缺血期間產(chǎn)生小劑量過氧化氫被推測是IPC的一個關鍵步驟［2］。最近研究表明，小劑量過氧化氫預處理的確能夠減輕線粒體鈣超載（Ca2＋overload），減少線粒體內(nèi)膜通透轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）開放，改善心功能［3］，但對相關機制爭論頗多。在本實驗中，我們首先證實，小劑量過氧化氫能夠有效保護再灌注導致的心功能損害；然后證明短暫缺氧導致過氧化氫生成；最后證明小劑量過氧化氫能夠預防線粒體細胞色素c釋放。這些嶄新的結(jié)果為進一步發(fā)現(xiàn)干預心肌再灌注損傷措施提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

魚藤酮（rotenone）、H2O2與 Anti-Cyt c購自 Sigma-Aldrich，H2-DCFDA為 Invetrogen產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)、缺氧模型建立與H2O2熒光觀察

H9c2大鼠心肌細胞系的分離培養(yǎng)參照本實驗室建立的常規(guī)方法［4］。H9c2傳代，鋪12孔板，細胞密度約80%。模擬缺血／缺氧用魚藤酮（5μmol／L）處理30 min，將藥物洗去后即導致再灌注損傷［5］。細胞內(nèi)H2O2產(chǎn)生量用熒光染料H2-DCFDA觀察。

1.3 實驗動物與分組

SD大鼠40只，雄性，體重（250±30）g，12周齡左右，購自軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心。大鼠隨機分為假手術組（Sham）、缺血／再灌注組（I／R）、缺血預適應組（IPC）和小劑量過氧化氫預處理組（H2O2）。

1.4 Langendorff實驗

Langendorff灌流基本步驟按實驗室常規(guī)進行［4］。大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后開胸取心臟，并快速將心臟置于Langendorff裝置。穩(wěn)定灌流20min后停灌30min，然后復灌2 h，此即經(jīng)典缺血／再灌注模型（I／R）建立（圖 1）。IPC是在缺血前給予 3個缺血（5 min）-再灌注（5 min）循環(huán)，H2O2的給藥時間點與此相同。左心室發(fā)展壓（left ventricular develop pressure，LVDP）與左室內(nèi)壓上升最大速率（maximum rate of left ventricular pressure rise，dp／dtmax）持續(xù)記錄，比較的時間點為再灌注后0.5 h與1 h。

Fig.1 Experimental design and representative cardiac pressure recording tracing

1.5 LDH活性測量

在復灌1 h收集流出液，-20℃保存待集中測量。LDH活性用試劑盒測定。

1.6 線粒體分離與mPTP誘導

先將Mito I分離液放入-20℃冷凍（30 min）成冰渣。麻醉 SD大鼠，取適量新鮮肝臟，立即在上述Mito I中，剪成1 cm3的小塊。稱取適量肝臟組織（約 0.142 g制成 2.4ml線粒體懸液），剪碎，研磨器中研磨至成為無組織塊存在的渾濁液體。離心10 min（4℃，600×g）后棄沉淀，將上清再離心 10 min（4℃，12 000×g），棄上清，沉淀即為線粒體，再用適量線粒體懸浮液重懸線粒體（約0.142 g肝臟組織加入2.4ml線粒體懸浮液），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

mPTP形成與開放用高鈣法誘導。將100μmol／LCa2＋加入線粒體懸液10 min，然后將各組線粒體離心15min（4℃，14 000×g），上清按適當比例與 5×loading buffer混勻，沸水煮8min。冰上冷卻后，離心 5min（3 000 r／min，4℃），-20℃保存。上清與沉淀進行 Cyt c半定量［4］。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel與Igor Pro，以均數(shù)±標準差（±s）表示［4］。單因素方差（One-way ANOVA）分析用Igor Pro軟件進行。

2 結(jié)果

2.1 小劑量過氧化氫預處理改善再灌注心功能下降

本實驗中，我們首先在全心臟水平建立缺血／再灌注損傷模型（I／R組），然后比較反復（3次）短暫（5 min）小劑量（10μmol／L）過氧化氫預處理（H2O2組）與經(jīng)典IPC改善心臟功能效能（圖1）。按照慣例，我們采用左心室發(fā)展壓（LVDP）與等容收縮期左室內(nèi)壓上升最大速率（dp／dtmax）作為衡量心功能的指標（圖2），用灌流液的乳酸脫氫酶（LDH）活性作為心肌再灌注損傷的指標（圖3）。結(jié)果顯示，再灌注1 h后，H2O2組和 IPC組的 LVDP（I／R組：（36±6.2）mmHg；IPC組：（63±4.8）mmHg；H2O2組：（77±5.3）mmHg）與 dp／dtmax（I／R組：（28±3.5）mmHg／s；IPC組：（58±3.1）mmHg／s；H2O2組：（56±5.8）mmHg／s）恢復均顯著好于IR組（圖2），而H2O2預處理的效果與IPC相當。LDH活性測量結(jié)果進一步支持H2O2預處理的效果與 IPC相當（Sham組：100%；I／R組：（320±65）%；IPC組：（130±23）%；H2O2組：（180±31）%（圖3）。這些結(jié)果提示，小劑量過氧化氫預處理能夠模仿經(jīng)典IPC對再灌注損傷的保護作用。

2.2 短暫缺血導致小劑量過氧化氫生成

由于小劑量過氧化氫預處理能夠模仿經(jīng)典IPC對再灌注損傷的保護作用，我們推測在短暫缺血期間，心肌細胞應該能夠產(chǎn)生低濃度過氧化氫。為了檢驗這個假設，我們采用一個經(jīng)典缺血／再灌注細胞模型［5］，實驗細胞為大鼠H9c2心肌細胞系，用魚藤酮（rotenone）造成細胞缺氧，以H2-DCFDA作為檢測H2O2的指標，該染料遇H2O2氧化時會發(fā)出綠色熒光。結(jié)果顯示，對照組（DMSO處理）細胞在連續(xù)觀察的1 h內(nèi)沒有顯示明顯的H2-DCFDA熒光，而魚藤酮處理組細胞在約1 min時就顯示H2-DCFDA綠色熒光，且熒光強度逐漸增加（圖4）。因此，短暫缺血確實能導致過氧化氫產(chǎn)生。

Fig.4 Rotenone-induced H2O2 production in H9c2 cardiac myocytes（H2-DCFDA×20）

2.3 小劑量過氧化氫預處理減少線粒體鈣誘導的細胞色素c釋放

以往研究顯示，小劑量過氧化氫預處理能夠減輕線粒體鈣超載，因此推測小劑量過氧化氫可能減少mPTP形成與開放，從而改善再灌注后心功能恢復。如果這個假設成立，那么小劑量過氧化氫預處理應該減少細胞色素c釋放，這可以在線粒體水平得到直接證實。我們采用經(jīng)典的肝臟線粒體細胞色素 c釋放模型，以100μmol／L Ca2＋模仿再灌注時的條件刺激mPTP形成與細胞色素c釋放，用Western blot檢測上清中細胞色素 c釋放量。結(jié)果顯示，Ca2＋處理10min能導致約70%Cyt c釋放，用1～100 μmol／L H2O2預防處理10 min后，發(fā)現(xiàn) H2O2在1～5 μmol／L時明顯減少高鈣刺激的Cyt c釋放（圖5，P＜0.05）。因此，我們的結(jié)果顯示在線粒體水平，小劑量過氧化氫預處理的確減少高鈣誘導的細胞色素c釋放。

Fig.5 Effects of H2O2 pretreatment on Ca2＋-induced cytochrome crelease（n＝3）

3 討論

mPTP形成與開放是再灌注損傷一個關鍵的臨床干預點［6］，我們推測可能是 H2O2的一個下游目標。雖然有關mPTP的分子身分仍然是一個迷，促進或抑制mPTP的形成與開放的許多因素已經(jīng)被鑒定出來，如蛋白激酶（PK）Cε的激活能夠抑制mPTP開放，從而與IPC有明確關系。PKC含有鋅指結(jié)構(gòu)（zinc finger），對 H2O2非常敏感［7］，因此可能是后者保護再灌注損傷的機制之一。

另一個明確的H2O2下游目標是同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）［8］。H2O2通過失活PTEN而激活PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）-Akt信號通路。該信號通路包括一系列公認的促進存活蛋白分子，從而發(fā)揮心肌保護作用。

上述的PKC、Akt都屬于“再灌注損傷拯救激酶（reperfusion injury salvage kinase，RISK）家族，其他具有心肌保護作用的成員如MAPK與JAK-STAT都是氧化還原（redox）敏感蛋白激酶，他們可能是H2O2的下游靶點，參與H2O2的心肌保護作用。

關于短暫缺血期間低水平H2O2產(chǎn)生的部位還不明確。早期結(jié)果提示，呼吸鏈復合體I和III是主要位點，本實驗中采用的魚藤酮其實也是復合體I的抑制劑，但最近發(fā)現(xiàn)復合體II產(chǎn)生的H2O2接近或超過復合體I或III。復合體II作為產(chǎn)生H2O2的位點將能揭開許多有關IPC的謎團。很久以前就知道，H2O2的產(chǎn)生與線粒體 ATP敏感鉀通道（mitoKATP）密切相關，阻斷 mitoKATP能夠阻斷 H2O2的產(chǎn)生與IPC。最近的結(jié)果顯示，復合體II可能就是mitoKATP［9］。目前我們實驗室正在進行相關研究工作。

心肌保護也可以通過使用某些藥物來實現(xiàn)，如鴉片類、緩激肽與苯腎上腺素。這類藥物都是與抑制型G蛋白（Gi）相偶聯(lián)，導致H2O2產(chǎn)生，中和H2O2將阻斷這些藥物的心肌保護作用［10］。不過這些藥物導致H2O2產(chǎn)生的部位不在線粒體，很可能是在細胞膜NADPH氧化酶。

綜上所述，本實驗從整體、細胞和線粒體水平分別證實了小劑量H2O2預處理能夠切實改善心臟功能，短暫缺氧導致H2O2產(chǎn)生，而小劑量H2O2預處理減少鈣超載誘導的mPTP形成與開放。

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