膽堿對雞胚絨毛尿囊膜血管新生的促進作用*

汪 匯，曾祥芝，崔文玉，段 煉△

（1.軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院，北京100071；2.北京賽德維康醫(yī)藥研究院，北京100039；3.軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，北京100850）

血管新生（angiogenesis）是指產生新的血管或從已存在的血管形成毛細血管的過程，不僅存在于機體生長發(fā)育的全過程，更是在創(chuàng)傷修復、缺血缺氧、炎癥等多種疾病或病理過程中扮演著重要的角色［1］。心肌組織缺血可促進血管新生，而膽堿能夠顯著促進心肌組織缺血誘導的血管新生，改善心肌缺血損傷，產生分子搭橋（molecular bypass）的生物效應［2］。膽堿屬B族維生素，不良反應小，毒性??；進一步的研究表明膽堿為煙堿受體α7亞型（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）的激動劑，血管內皮細胞α7受體參與體內血管新生的調節(jié)，為膽堿調節(jié)血管新生的分子靶標。

煙霧?。╩oyamoya disease）又稱自發(fā)性基底動脈環(huán)閉塞癥，是一種原因不明的以雙側頸內動脈及大腦前、中動脈起始部動脈管腔逐漸狹窄以致閉塞，腦底穿通動脈代償性擴張為特征的疾病，其發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程中血管新生發(fā)揮了重要的作用［3］。煙霧病的手術治療通過直接或間接血管重建等方式形成顱內外血管溝通，建立缺血腦區(qū)的側枝循環(huán)，改善腦缺血損傷［4］。缺血腦區(qū)對血管新生的促進作用，直接影響其治療效果。腦血管內皮細胞存在α7受體的表達，因此，研究膽堿對腦組織缺血誘導血管新生的影響，對于尋找煙霧病綜合治療新技術有重要價值。本研究以雞胚絨毛尿囊膜（chick embryo chorioallantoicmembrane，CAM）血管新生為模型［5］，評價膽堿對血管新生的影響，為研究促進血管新生的治療新技術提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

受精雞卵購自北京藍風家禽養(yǎng)殖有限公司；氯化膽堿購自美國Sigma-Aldrich公司；hVEGF購自美國PerproTech公司；混合纖維素微孔濾膜（孔徑0.45 μm）購自北京升河誠信膜科技發(fā)展中心；打孔器制成直徑0.6 cm的圓片載體，120℃20 min高壓濕熱滅菌，無菌生理鹽水浸泡兩次后備用；LRH-250生化培養(yǎng)箱。

1.2 藥物對血管新生影響的檢測

受精雞卵以1‰新潔爾滅清洗后放入37.5℃，60%相對濕度的孵箱內孵育，鈍端向上與蛋托呈45度角，每天翻轉至少2次。孵育至第7天時（滿24 h為一天），在照蛋器指示下，用鉛筆標記出雞卵氣室區(qū)域。將雞卵移至超凈工作臺中，酒精棉球消毒后，用砂輪磨切蛋殼。待磨出一凹痕后，用牙探針的尖端勾開蛋殼，用眼科彎鑷小心夾去蛋殼及殼膜，窗口大小由氣室大小決定，一般距離氣室底邊約0.5 cm。滴加2滴生理鹽水使雞胚絨毛尿囊膜下塌，與卵殼膜分離，去除卵殼膜，暴露雞胚絨毛尿囊膜。

將甲基纖維素微孔濾膜載體置于雞胚絨毛尿囊膜上相對無血管區(qū)域，用微量移液器向載體上滴入20μl藥物，透明膠帶封口，繼續(xù)孵育3 d，不再翻轉。

繼續(xù)孵育至第11天，揭去膠帶，向雞胚絨毛尿囊膜上滴入等量甲醇、丙酮配成的固定液，固定15 min，剪下雞胚絨毛尿囊膜，平鋪于玻片上，用數(shù)碼相機攝片［6］。以載體為中心，計數(shù)載體周圍0.3 cm范圍處與計數(shù)環(huán)相交叉的的血管數(shù)。

1.3 實驗分組

第一批實驗共分8組（n＝11）：生理鹽水組、hVEGF陽性對照組（1μg／L）、氯化膽堿 0.01、0.1、1、10、100和 1 000μmol／L組。第二批實驗共分 7組（n＝11）：生理鹽水組、hVEGF陽性對照組（1μg／L）、氯化膽堿 0.1、0.5、1、5和 10 nmol／L組。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用Excel進行統(tǒng)計分析，組間差異采用t檢驗。

2 結果

2.1 雞胚存活情況

存活雞胚的胚體活動活躍，動脈血管搏動有力，CAM透明，血管呈葉脈狀分布，顏色鮮紅，脈絡清晰。死亡雞胚的胚體上浮，顏色發(fā)白，活動停止，CAM血管顏色淺淡，脈絡消失。第一批實驗雞胚孵化成功率為 91.0%，第二批實驗孵化成功率為86.2%。

2.2 氯化膽堿對CAM血管新生的促進作用

氯化膽堿 0.01～1 000μmol／L各濃度組和hVEGF組血管數(shù)均多于生理鹽水組，具有顯著性差異（表1，圖1）；氯化膽堿各濃度組與hVEGF陽性對照組之間相比均無顯著性差異，表明氯化膽堿可促進雞胚絨毛尿囊膜血管新生。

Tab.1 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

Tab.1 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Vessels counted Control Saline 9 23.67±3.29 Choline 0.01 10 31.90±6.05**（μmol／L） 0.1 10 28.95±4.32*1.0 10 29.15±3.37**10 8 28.13±4.26*100 11 29.45±6.85*1000 9 31.22±7.28*hVEGF（μg／L） 1 7 30.14±4.38 Group Doses n**

Fig.1 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick chorioallantoicmembranes

2.3 氯化膽堿對促進CAM血管新生作用的最低有效劑量濃度

為研究氯化膽堿促進血管新生的最低有效濃度，實驗中膽堿濃度從 10 nmol／L進一步降至 0.5 nmol／L，結果顯示氯化膽堿濃度在 0.5～5 nmol／L時無促進血管新生的作用，當劑量濃度增至10 nmol／L時具有促進血管生成的作用，新生血管的數(shù)量多于生理鹽水對照組（表2，圖2）。表明氯化膽堿促進血管新生的最低有效濃度為10 nmol／L。

Tab.2 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

Tab.2 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Vessels counted Control Saline 7 33.43±8.62 Choline 0.1 11 35.14±9.46（nmol／L） 0.5 8 30.57±6.88 1 10 33.28±3.64 5 9 37.11±6.97 10 10 47.30±6.65**hVEGF（μg／L） 1 7 41.71±5.12 Group Doses n*

3 討論

CAM是雞胚外的一層膜，主要功能是提供進行氣體交換的表面，同時CAM功能的行使也依賴于致密的血管網的支撐，正是由于雞胚發(fā)育過程中大量尿囊膜血管的形成，為研究血管發(fā)生和形成提供了很好的實驗模型。由于雞胚早期免疫系統(tǒng)發(fā)育不全，對所加測試藥物不會產生排斥反應，實驗結果可在顯微鏡甚至肉眼下直接觀察。同時，此模型實驗材料易得、操作簡便、實驗周期短、成本較低，因此CAM模型成為研究血管形成的一種理想模型［6］。

本研究應用雞胚絨毛尿囊膜作為實驗模型，發(fā)現(xiàn)膽堿可促進血管新生。目前認為hVEGF為最強的促進血管新生的生物因子，在本實驗條件下，發(fā)現(xiàn)氯化膽堿促進血管新生的作用強度與hVEGF相當。另一方面，其最低有效濃度低，僅為10 nmol／L；有效濃度范圍寬，為 10 nmol／L～1 mmol／L之間，且氯化膽堿各濃度組之間無顯著性差異，提示臨床應用膽堿促進血管新生的劑量易于控制。

膽堿作為α7受體的配體，可激活和失敏α7受體［7］。一方面，膽堿激活α7受體能夠增加胞內Ca2＋釋放、內皮細胞增殖及體外血管索形成，促進血管新生和缺血心肌區(qū)側枝循環(huán)的建立［8］。另一方面，膽堿的有效濃度范圍寬，可能與其可誘導α7受體功能失敏有關，避免過度激活α7受體，調控其促進血管新生的作用。

應用藥物促進血管新生，刺激缺血區(qū)小血管生長，促進側枝循環(huán)形成，目前已經成為缺血性心腦血管疾病及其治療技術研究領域的熱點之一。本研究發(fā)現(xiàn)膽堿促進血管新生作用不僅作用強，而且有效劑量范圍寬。由于膽堿的安全性好，毒性低，不良反應小，因此，以膽堿作為促進血管新生的新技術具有進一步的研究價值。

【參考文獻】

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