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    內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌iNOS活性和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化*

    2013-03-19 09:07:14方迎艷關(guān)宿東郭曉磊葉紅偉汪華學(xué)
    關(guān)鍵詞:明顯降低內(nèi)毒素比值

    方迎艷,關(guān)宿東,郭曉磊,葉紅偉,汪華學(xué),高 琴△

    (1.蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,安徽 蚌埠233030;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院ICU,安徽 蚌埠233004)

    內(nèi)毒素的主要成分脂多糖是細(xì)菌致病的主要物質(zhì)之一,進(jìn)入機(jī)體可引起內(nèi)毒素血癥或膿毒血癥,導(dǎo)致機(jī)體多器官損傷和功能障礙。呼吸功能障礙是內(nèi)毒素血癥最常見、致命的并發(fā)癥之一,內(nèi)毒素血癥休克病程中膈肌收縮功能嚴(yán)重?fù)p傷,與結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase,cNOS)和誘導(dǎo)型 NOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)顯著激活有關(guān)[1,2]。近年來研究觀察到,內(nèi)毒素引起的膈肌損傷與局部炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生過多、氧自由基明顯增加和蛋白質(zhì)水解途徑(鈣蛋白酶和半胱天冬酶 caspase)的激活密切相關(guān)[3],caspase-3可引起肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白釋放,誘導(dǎo)膈肌無力[4]。本實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌iNOS活性和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA表達(dá)的變化,探討內(nèi)毒素血癥膈肌損傷的細(xì)胞凋亡機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 藥品、主要試劑

    沙門氏菌屬精制內(nèi)毒素L-2880購自Sigma公司;總RNA提取試劑(Trizol)購自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒購自Fermentas公司;NOS(分型)、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)和蛋白定量檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Bax、Bcl-2和caspase-3引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列如下:βactin(630 bp),上游:5'-GATGGTG GGTATGGGT CAGAAGGAC-3',下游:5'-GCTCATTGCCGA TAGTGATGACT-3';Bax(494 bp),上游:5'-GGATCGAGCAGAGAGGA TGG-3',下游:5'-TGGTGAGTGA GGCAGTGAGG-3’;Bcl-2(227 bp)上游:5'-CTGGTGGA CAACATCGCT CTG-3',下 游:5'-GGTCTGCTGACCTCA CTTGTG-3';caspase-3(349 bp),上 游:5'-AAGCC GAAACTCTTCA TC-3',下游:5'-TCAGCA TTGACAC AATACAC-3'。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

    成年雄性SD大鼠32只,體重為200~250 g,清潔級(jí),由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成4組(n=8):生理鹽水對(duì)照組和內(nèi)毒素24 h組,48 h組,96 h組,即內(nèi)毒素腹腔注射12 mg/kg,分別于注射內(nèi)毒素后 24 h、48 h、96 h處死大鼠[5],處死前稱量各組大鼠體重。

    1.3 膈肌標(biāo)本的采集

    水合氯醛麻醉后斷頭處死大鼠,速取膈肌并稱重,計(jì)算膈肌重/體重比。在冰生理鹽水漂洗后秤膈肌100 mg,液氮凍存后-80℃低溫冰箱保存行 RTPCR檢測備用,剩余部分-80℃低溫冰箱保存生化指標(biāo)檢測備用。

    1.4 膈肌組織iNOS、cNOS和SDH檢測

    取膈肌組織制成10%的組織勻漿,分別檢測i-NOS、cNOS和SDH活性,嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

    1.5 RT-PCR檢測 Bcl-2、Bax和 caspase-3 mRNA的表達(dá)

    取100 mg膈肌組織,采用Trizol一步法提取組織總RNA 3μg為模板,隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。一次 cDNA 1.5μl為模板 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 3 min后,以(1)95℃ 50 s變性;(2)βactin退火溫度59.5℃,50 s;Bcl-2退火溫度 61.7℃,50 s;Bax退火溫度 62.3℃,50 s;Caspase-3退火溫度55.6℃,50 s;(3)72℃ 60 s,反應(yīng) 30個(gè)循環(huán)。取 5μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠顯色。GIS凝膠處理系統(tǒng)拍攝記錄,使用圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行光密度掃描做半定量分析,以目的基因與內(nèi)參對(duì)照的積分吸光度比值(Bcl-2/β-actin;Bax/βactin;caspase-3/β-actin)表示 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

    1.6 統(tǒng)計(jì)分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),各組采用單因素方差(one-way ANOVA)分析,并用 Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠體重和膈肌重/體重比

    與正常對(duì)照組比較,內(nèi)毒素血癥大鼠96 h組體重和膈肌重/體重比值明顯降低(P<0.05,P<0.01,表 1)。

    Tab.1 Body weight and diaphragm/body weight ratio of rats(±s,n=8)

    Tab.1 Body weight and diaphragm/body weight ratio of rats(±s,n=8)

    *P<0.05,**P<0.01 vs control group

    Group Body weight(g)Diaphragm weight/body weight(×10-3)Control 286.86±11.00 3.20±0.22 Endotoxin 24 h 285.63±12.66 3.22±0.22 Endotoxin 48 h 275.63±7.76 3.13±0.14 Endotoxin 96 h 253.13±7.99** 2.93±0.23*

    2.2 膈肌組織NOS和SDH活性變化

    與正常對(duì)照組比較,內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌cNOS和iNOS活性明顯增強(qiáng),48 h、96 h組較24 h組明顯升高(P<0.01),24 h組較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.01);內(nèi)毒素血癥96 h和48 h組 SDH活性明顯降低,96 h組較24 h組降低明顯(P<0.05),24 h組與正常對(duì)照組無明顯差別(表2)。

    Tab.2 NOSand SDH activities of diaphragm tissue in rats(±s,n=8)

    Tab.2 NOSand SDH activities of diaphragm tissue in rats(±s,n=8)

    cNOS:Constitutive nitric oxide synthase;iNOS:Inducible nitric oxide synthase;SDH:Succinate dehydrogenase*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs endotoxin 24 h;△△P<0.01 vs endotoxin 48 h

    G r o u p c N O S(U/m g p r o)i N O S(U/m g p r o)S D H(U/m g p r o·m i n )C o n t r o l 0.1 2±0.0 5 0.0 2±0.0 1 8.1 6±0.2 8 E n d o t o x i n 2 4 h 0.3 6±0.0 4** 0.2 1±0.0 5** 7.8 5±0.2 9 E n d o t o x i n 4 8 h 0.6 1±0.1 0**## 0.4 0±0.0 5**## 7.5 8±0.5 0*E n d o t o x i n 9 6 h 0.7 9±0.1 1**#?!鳌?0.6 4±0.1 3**##△△ 7.3 2±0.3 8**#

    2.3 膈肌組織Bcl-2、Bax和caspase-3的變化

    與正常對(duì)照組比較,內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌Bax mRNA的表達(dá)顯著升高,內(nèi)毒素48 h、96 h組較24 h組明顯升高,且96 h組較48 h組明顯升高;Bcl-2mRNA的表達(dá)及Bcl-2/Bax mRNA比值明顯降低,48 h、96 h組較24 h組有明顯降低,且96 h組較48 h組明顯降低(P<0.01,圖 1A和圖 1B,表 3);caspase-3 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng),48 h、96 h組較24 h組明顯增強(qiáng),且 96 h組較48 h組明顯增強(qiáng)(P<0.01,圖 1,表 3)。

    Fig.1 Changes of Bcl-2(A),Bax(B)and caspase-3(C)mRNA expressions of diaphragm tissue in rats

    3 討論

    內(nèi)源性一氧化氮主要是由NOS催化L-精氨酸生成。NOS主要包括三種:iNOS、內(nèi)皮型 NOS(endothelial NOS,eNOS)和神經(jīng)型 NOS(neuronal NOS,nNOS)。其中 eNOS與 nNOS合稱為結(jié)構(gòu)型 NOS(cNOS)。正常生理情況下,iNOS基因不表達(dá),只有在內(nèi)毒素和某些細(xì)胞因子的刺激下才能產(chǎn)生和表達(dá),并在輔助因子和還原型輔酶Ⅱ的作用下生成大量一氧化氮(nitric oxide,NO)。脂多糖誘導(dǎo)的敗血癥休克大鼠模型,直接呈休克晚期癥狀,總NOS、iNOS和 cNOS表達(dá)增加[6],內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌以cNOS為主要構(gòu)型,iNOS顯著激活,但NO途徑可能不參與內(nèi)毒素血癥膈肌肌漿網(wǎng)釋放Ca2+障礙[1],也不調(diào)控神經(jīng)肌肉接頭的信息傳遞,在膈肌收縮功能障礙中不發(fā)揮重要作用[2]。經(jīng) iNOS產(chǎn)生的NO發(fā)揮毒性作用,高濃度的NO在體內(nèi)形成ONOO-,破壞線粒體結(jié)構(gòu)的完整性,誘導(dǎo)線粒體膜通道開放,釋放出細(xì)胞色素 C,引起 caspase的激活[7],同時(shí)還可上調(diào)腫瘤抑制蛋白p53,后者可上調(diào)促凋亡蛋白Bax和下調(diào)抗凋亡蛋白 Bcl-2[8],Bcl-2/Bax的比值影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax可以導(dǎo)致凋亡促進(jìn)因子從線粒體中被釋放、下游caspase被活化和線粒體功能喪失,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。目前 caspase-3是公認(rèn)的凋亡過程中最重要的蛋白酶,是多條凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分,與多種細(xì)胞發(fā)生凋亡變化有密切關(guān)系。Caspase-3既是一種最重要的執(zhí)行酶,同時(shí)也是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶。脂多糖干預(yù)的大鼠心臟Bcl-2表達(dá)下降,Bax表達(dá)進(jìn)一步增加,Bcl-2/Bax比值下降,隨干預(yù)的時(shí)間延長,器官受損程度逐漸加重,細(xì)胞凋亡增加[10]。大鼠腹腔注射內(nèi)毒素96 h后caspase-3活性顯著增強(qiáng),激活經(jīng)caspase介導(dǎo)的膈肌無力[5]。SDH是所有需氧的細(xì)胞線粒體三羧酸循環(huán)(糖代謝途徑)酶系中的一種脫氫酶,即線粒體標(biāo)志酶和三羧酸循環(huán)的限速酶。

    本實(shí)驗(yàn)中檢測到:內(nèi)毒素血癥大鼠96 h組膈肌質(zhì)量和SDH活性明顯降低,說明膈肌萎縮和線粒體損傷;膈肌組織iNOS活性明顯增強(qiáng),并隨干預(yù)時(shí)間的延長,激活明顯增強(qiáng);Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)顯著增加,Bcl-2 mRNA表達(dá)和 Bcl-2/Bax比值明顯降低,并隨著干預(yù)的時(shí)間延長,變化明顯加劇,提示Bcl-2抑制凋亡的作用明顯降低,Bax促凋亡作用增強(qiáng),激活caspase-3,導(dǎo)致膈肌細(xì)胞凋亡,隨著干預(yù)時(shí)間的延長,促凋亡的作用加強(qiáng),啟動(dòng)膈肌細(xì)胞凋亡,促成膈肌萎縮。

    Tab.3 Expressions of Bcl-2,Bax and caspase-3mRNA of diaphragm tissue in rats(±s,n=8)

    Tab.3 Expressions of Bcl-2,Bax and caspase-3mRNA of diaphragm tissue in rats(±s,n=8)

    **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs endotoxin 24 h;△△P<0.01 vs endotoxin 48 h

    Group Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Bcl-2/Bax Caspase-3/β-actin Control 0.88±0.04 0.49±0.06 1.18±0.26 0.14±0.01 Endotoxin 24 h 0.78±0.02** 0.68±0.07** 1.17±0.15** 0.29±0.03**Endotoxin 48 h 0.58±0.05**## 0.84±0.12**## 0.71±0.10**## 0.42±0.03**##Endotoxin 96 h 0.47±0.03**##△△ 1.07±0.12**#?!鳌?0.44±0.05**##△△ 0.54±0.05**#?!鳌?/p>

    綜上所述,內(nèi)毒素血癥大鼠隨病程的延長,膈肌組織iNOS活性顯著增強(qiáng),誘導(dǎo)產(chǎn)生NO的毒性作用損傷線粒體,上調(diào)促凋亡基因Bax和下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2,啟動(dòng)經(jīng)caspase-3的細(xì)胞凋亡途徑,導(dǎo)致膈肌損傷和萎縮。

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