人腸道病毒分型方法和鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展

張曉玲，胡蕓文，周志統(tǒng)

上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

人腸道病毒(human enterovirus，HEV)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)中腸道病毒屬。病毒為單股正鏈RNA，大小約7.5 kb。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白為VP1～4，VP1～3位于病毒表面，其抗原決定簇決定腸道病毒血清型，而VP4在病毒內(nèi)部。

HEV主要通過糞-口途徑傳播，少數(shù)也經(jīng)呼吸道傳播，可引起多種不同臨床表現(xiàn)的疾病，包括發(fā)熱、腹瀉、出疹、無菌性腦膜炎、腦膜腦炎、心肌炎、肺水腫和急性弛緩性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)等[1]。近年來，一些研究表明HEV還與慢性病如1型糖尿病[2,3]等相關(guān)。

1 HEV的分型方法

1.1 傳統(tǒng)分型法

傳統(tǒng)的HEV分型主要基于病毒分離和抗血清中和試驗(yàn)?？滤_奇病毒 (coxsackievirus, CV)的分離是將呼吸道和糞便標(biāo)本等接種于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，待產(chǎn)生細(xì)胞病變后，通過抗血清中和試驗(yàn)進(jìn)行血清型定型[4]。這種方法將HEV分為64種血清型，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus,PV)1～3，柯薩奇病毒A組(coxsackievirus A,CVA)1～22、CAV24和柯薩奇病毒B組(coxsackievirus B,CVB)1～6，?？刹《?echovirus,ECV)1～7、ECV9、ECV11～21、ECV24～27、ECV29～33和HEV68～71。

1.2 基因分型法

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于病毒核苷酸序列分析的分型方法越來越多地被應(yīng)用。這種方法是根據(jù)病毒的分子特點(diǎn)進(jìn)行分型。1970年國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)將脊髓灰質(zhì)炎病毒﹑柯薩奇病毒和?？刹《局蟊话l(fā)現(xiàn)的HEV按序號(hào)命名。參考ICTV小RNA病毒組的最新數(shù)據(jù)，2000年至今已發(fā)現(xiàn)40余種新型HEV，最新序號(hào)到了HEV-A119 (http://www.picornastudygroup.com/types/enterovirus/ev_types.htm)。

1.2.1基于VP1序列分析定型1999年，Oberste等[5]對(duì)HEV VP1區(qū)核酸序列進(jìn)行研究，建立了根據(jù)VP1基因序列分析來鑒定HEV型別的方法。他們通過對(duì)47株HEV血清型原型株和10株抗原變異株的VP1全長(zhǎng)序列測(cè)序，聯(lián)合GenBank中可利用的序列，構(gòu)成了一個(gè)包含66種HEV原血清型和另外7種血清型的VP1序列數(shù)據(jù)庫，用這些VP1序列建立的系統(tǒng)發(fā)生樹，將HEV分為A～D組。另外，根據(jù)被鑒定的核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫中所有HEV血清型參考株的核苷酸序列比對(duì)的結(jié)果，制訂了如下分型規(guī)則：如被鑒定的毒株與同源性最高的參考株序列相似性>75%，且與同源性第2的參考株相似性<70%，該毒株與同源性最高的參考株為同一型；如與同源性最高的參考株序列相似性<70%，則區(qū)分為不同的HEV型別；如與同源性最高的參考株序列相似性<75%或與同源性第2的參考株相似性>70%，則有待進(jìn)一步確定。由此，原HEV22、HEV23型被獨(dú)立劃為一個(gè)新的小RNA 病毒屬：雙埃可病毒(parechovirus)，分別稱作HPeV 1型(HEV22)和 HPeV2型(HEV23)，至今已確認(rèn)的雙埃可病毒有14種，包括HPeV1～14 (http://www.picornastudygroup.com/)。近年的研究認(rèn)為，人雙?？刹《究赡苁菍?dǎo)致一些嬰幼兒嚴(yán)重臨床并發(fā)癥的病原體[6,7]。

2001年，Caro等[8]設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，可擴(kuò)增腸道病毒1 452 bp的基因片段，跨越VP1的3′端、2A、2B和2C 5′端的部分區(qū)域。通過對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)產(chǎn)物測(cè)序，鑒定出64株原型株中的59個(gè)型，并對(duì)45株不同來源的分離株和6株用血清學(xué)方法未能定型的病毒株進(jìn)行了分型。根據(jù)建立的系統(tǒng)發(fā)生樹，他們還將HEV分為5個(gè)亞組，形成了一個(gè)新的HEV分類方法。

總之，VP1序列分析定型的特點(diǎn)是與中和試驗(yàn)結(jié)果的一致性較好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，是HEV分子分型最常用的方法。

1.2.2基于VP4序列分析定型Chu等[9]對(duì)1998年臺(tái)灣暴發(fā)的手足口病做流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，采用VP4全長(zhǎng)序列建立了HEV的定型分析方法，其結(jié)果與基于VP1序列的定型方法有較高的符合率。2002年Kubo等[10]對(duì)6份手足口病伴無菌性腦炎的病例標(biāo)本嘗試HEV分型，也采用了對(duì)VP4序列分析的方法，結(jié)果與血清學(xué)檢測(cè)方法一致。

VP4全長(zhǎng)序列僅有207個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)，比VP1基因序列(834 ～ 951 nt)短得多，因而基于VP4序列的分型方法更便捷和快速。另外，由于VP4處在病毒內(nèi)部，基因序列較為穩(wěn)定，所以可能更適用于HEV的分型。

1.2.3基于多段序列分析定型HEV的不同基因區(qū)域存在不同突變率，而HEV不同型別之間也可能發(fā)生重組[11-13]。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了HEV不同型別間存在的重組現(xiàn)象，如Smura等[14]從AFP病例和健康個(gè)體的腸道株中發(fā)現(xiàn)EV96株其實(shí)是HEV C組與脊髓灰質(zhì)炎病毒的重組產(chǎn)物；Yozwiak等[15]的研究顯示，HEV109是HEV A組與C組的重組產(chǎn)物。因此，基于HEV的單一區(qū)域進(jìn)行序列分析而定型的方法并非完全可靠。

為了更準(zhǔn)確地對(duì)臨床分離的HEV株進(jìn)行分型，Manzara等[16]采用了多片段序列分析定型的方法。除VP1、VP4-VP2序列分析外，他們還加入了5′非編碼區(qū)序列進(jìn)行分析，將3段區(qū)域序列分析的方法聯(lián)合使用，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)其收集的所有HEV標(biāo)本的分子分型。此外，要得到精確、可信的分型結(jié)果，還需對(duì)HEV的每一段序列分析建立嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。

2 HEV型別的鑒定

2.1 病毒分離和抗血清中和試驗(yàn)

從臨床獲得的不同類型標(biāo)本，如鼻咽拭子、糞便、皰疹液、腦脊液等，經(jīng)處理后接種到細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離和培養(yǎng)。常用的細(xì)胞系包括人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(CaCo-2)、人肺癌細(xì)胞(A549)、人喉癌細(xì)胞(Hep-2C)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人胎成纖維細(xì)胞(HFF)、綠猴腎細(xì)胞系(GMK、Vero、LLC)、小鼠轉(zhuǎn)人脊髓灰質(zhì)炎受體細(xì)胞(L20B)[17]、小鼠轉(zhuǎn)CVB受體細(xì)胞(L-hCAR)[18]等。產(chǎn)生細(xì)胞病變后，用組合血清初步定型，再用特異的單型抗血清證實(shí)。目前常用的LBM組合血清(A～H)可鑒別42個(gè)型的HEV(包括ECV22、ECV23)。如果未鑒定成功，可再用含19個(gè)型的CVA抗體組合(J～P)進(jìn)行鑒定[19]。另一種組合血清是目前世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦各國(guó)脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的RIVM，在LMB組合血清的基礎(chǔ)上還增加了對(duì)HEV68～71 型鑒定[20]。國(guó)內(nèi)有中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所配制的KMB組合血清，能鑒定CVA9、CVB、ECV等共28個(gè)血清型。

上述傳統(tǒng)分型方法一直是業(yè)內(nèi)“金標(biāo)準(zhǔn)”，但存在很多限制。如細(xì)胞培養(yǎng)方面的問題包括：①獲得多種對(duì)HEV敏感的細(xì)胞系較困難；②維持多種細(xì)胞系生長(zhǎng)費(fèi)用較高；③同時(shí)采用多種細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離，雖可提高病毒分離率，但工作量大大增加；④一些新發(fā)現(xiàn)的病毒不能體外培養(yǎng)，如HEV104[21]，部分CVA只能用接種乳鼠的方法進(jìn)行分離；⑤細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，判斷病變存在主觀因素，整個(gè)過程耗時(shí)、耗力。組合血清鑒定方面的問題包括：①HEV血清型繁多，目前可供鑒定使用的抗血清(RIVM、LBM和KMB)尚不足以覆蓋全部HEV型別，當(dāng)抗原變異、出現(xiàn)新的病毒或標(biāo)本中有多種病毒時(shí)，就可能無法鑒定；②某些型別之間有共同抗原而存在交叉反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不可靠[22,23]。

2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)聯(lián)合序列測(cè)定是目前用于HEV基因分型的常用技術(shù)。2003年，Bourlet等[24]采用梯度PCR，區(qū)分全部64種不同血清型的HEV。Oberste等[25]針對(duì)3′非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了種特異性RT-PCR引物，可實(shí)現(xiàn)HEV A～D組的快速篩查。隨后又進(jìn)一步設(shè)計(jì)了半套式PCR(semi-nested PCR,snPCR)[26]，可對(duì)64種原血清型和22種新血清型的HEV進(jìn)行分型。

與傳統(tǒng)病毒分離和抗血清中和分型方法相比，PCR簡(jiǎn)便、快速、費(fèi)用低，適合臨床診斷。將PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床HEV標(biāo)本進(jìn)行高靈敏度、高特異度分型。但RT-PCR方法易引起實(shí)驗(yàn)室污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施條件和操作人員技術(shù)有較高要求。

2.3 核酸雜交和自動(dòng)化測(cè)序

2.3.1核酸雜交根據(jù)HEV不同血清型在基因序列上存在高度保守區(qū)的特點(diǎn)，20世紀(jì)90年代初Rotbart等[27]使用cDNA探針檢測(cè)多種HEV。這種雜交方法與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法相比，對(duì)腦脊液標(biāo)本檢測(cè)的靈敏度和特異度都較差，對(duì)糞便標(biāo)本檢測(cè)的靈敏度也不高。

相比cDNA探針，RNA探針有更高的親和性，且無載體序列干擾，避免了非特異性雜交。Rotbart等[28]將3種RNA探針聯(lián)合使用，可檢測(cè)16種HEV，而Cova等[29]設(shè)計(jì)的單RNA探針可檢測(cè)12種HEV血清型。盡管RNA探針與cDNA探針相比，其檢測(cè)靈敏度有所提高，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到臨床診斷的要求[30]。

2.3.2自動(dòng)化測(cè)序桑格雙脫氧核苷酸終止法測(cè)序是過去測(cè)序的主導(dǎo)方法，但因費(fèi)用高、時(shí)間限制等原因，無法普遍應(yīng)用。新一代的焦磷酸測(cè)序技術(shù)開創(chuàng)了基因序列測(cè)序的新紀(jì)元，引發(fā)了高通量數(shù)據(jù)分析的熱潮，為臨床研究和診斷應(yīng)用展現(xiàn)了新的前景[31]。代表的商業(yè)公司有Roche/454 Life Sciences Ion Torrent、Illumina/Solexa、Applied Biosystems Solid等，以及產(chǎn)品正在開發(fā)中的VisiGen和Pacific Biosciences[32]。新型HEV109就借助了新一代測(cè)序技術(shù)，從尼加拉瓜流行性感冒患者的鼻咽拭子中檢測(cè)到全長(zhǎng)基因序列[15]。

總之，新一代測(cè)序技術(shù)引入了宏基因組的概念，臨床診斷實(shí)驗(yàn)室在實(shí)現(xiàn)快速篩查臨床HEV標(biāo)本或發(fā)現(xiàn)新型HEV的同時(shí)，也必將迎來新一輪挑戰(zhàn)，包括如何正確處理龐大的數(shù)據(jù)、合理解釋基因突變等問題。

3 展望

HEV型別眾多，引起的臨床癥狀多種多樣?；诓《竞塑账嵝蛄械幕蚍中头椒ㄔ絹碓蕉嗟乇粦?yīng)用，為發(fā)現(xiàn)新型HEV提供了有效工具，也有利于深入研究HEV基因重組變異和毒力改變等生物學(xué)特性。盡管基因分型方法與基于病毒分離和抗血清中和試驗(yàn)的傳統(tǒng)分型方法有較高的符合率，但血清分型方法仍是經(jīng)典的HEV分型方法，基因分型方法不能完全取代。

對(duì)HEV的準(zhǔn)確分型，不僅可為臨床快速診斷和治療提供依據(jù)，還能監(jiān)測(cè)HEV的感染人群和區(qū)域，對(duì)控制疫情蔓延、開展流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

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