獲得構(gòu)建miRNA高表達載體的pre-miRNA及其側(cè)翼DNA序列的生物信息學(xué)方法

李嘉熙，宋劉梅，王美晨，藍 茜，李 玥，劉 莉，王 璇，韓 燕，李冬民

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部:1生物化學(xué)與分子生物學(xué)系;2臨床醫(yī)學(xué)七年制，西安 710061

MicroRNA(miRNA)是一類長約20-24個核苷酸、具有重要調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小RNA。miRNA基因通常在RNA聚合酶II作用下從基因組轉(zhuǎn)錄出長約300～1 000個堿基的初級miRNA(即primary mi-RNA、簡寫為pri-miRNA)，經(jīng)核內(nèi)Drosha酶復(fù)合體剪接加工生成長約70～90個堿基、含有莖環(huán)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA前體(即precursor miRNA、簡寫為premiRNA)，然后pre-miRNA被運送到胞質(zhì)再經(jīng)Dicer酶酶切后生成長約20～24個核苷酸的miRNA:mi-RNA*雙鏈;這種雙鏈很快被組裝進入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silence complex，RISC)中，其中一條成熟的單鏈miRNA通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)RISC降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻譯［1-3］。最近研究表明，miRNA在細胞增殖和凋亡、發(fā)育、造血、脂肪代謝、器官形成、病毒防御等眾多生命活動過程中具有非常重要的調(diào)節(jié)作用［4-7］，因此，對于其功能的闡明成為各領(lǐng)域研究的熱點。

目前，miRNA表達載體是miRNA功能研究使用最多、最廣泛的手段之一;實際研究中，pre-miRNA應(yīng)用最早，也最廣泛，目前很多商業(yè)化的MicroRNA庫都是pre-miRNA形式的。近幾年來，研究發(fā)現(xiàn)premiRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)兩側(cè)的序列(即microRNA的雙臂)對成熟miRNA的形成有著十分重要的作用［8］，premiRNA+側(cè)翼序列的表達載體形式越來越多地被研究者采用，而獲得miRNA前體及其側(cè)翼的DNA序列是miRNA表達載體構(gòu)建技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。盡管目前已有很多miRNA的數(shù)據(jù)庫［9］，但尚未有文獻詳細報道如何獲得pre-miRNA及其側(cè)翼的DNA序列。因此，該文將詳細介紹如何聯(lián)合利用miRBase和Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得某個特定miRNA的前體(premiRNA)及其側(cè)翼的DNA序列。

1 miRBase和Ensembl序列數(shù)據(jù)庫簡介

1．1 miRBase序列數(shù)據(jù)庫介紹

miRBase序列數(shù)據(jù)庫是曼徹斯特大學(xué)小RNA數(shù)據(jù)庫，是一個提供包括miRNA序列數(shù)據(jù)、注釋、預(yù)測基因靶標等信息的全方位數(shù)據(jù)庫，是存儲miRNA信息最主要的公共數(shù)據(jù)庫之一，其網(wǎng)址是:http://www．mirbase．org［10］。它主要由三部分組成:miRNADatabase、miRBase Registry和miRBase Targets database。miRBase database也就是miRBase Sequence Database，主要提供的是已公布的miRNA序列(包括預(yù)測的pre-miRNA，成熟miRNA序列(稱為miR)的位置和序列信息)和注釋的搜索服務(wù)，發(fā)夾和成熟序列都可以通過mi-RBase里的searching和browsing找到，也可通過名稱、關(guān)鍵詞、參考文獻和注釋進行檢索。miRBase Registry主要為miRNA提供注冊服務(wù)，即為研究者們在研究結(jié)果發(fā)表之前給每個新發(fā)現(xiàn)的miRNA基因一個惟一的名稱。而miRBaseTargets data-base(即miRNA靶標預(yù)測)目前已更名為microCosm并托管于EBI(european bioinformatics institute)，主要針對動物miRNA靶基因的查詢［10-11］。

1．2 Ensembl數(shù)據(jù)庫簡介

Ensembl數(shù)據(jù)庫是三大人類基因組數(shù)據(jù)庫(NCBI、USUC和Ensembl)之一，是歐洲生物信息學(xué)研究所(the European Bioinformatics Institute，EBI)與英國 Wellcome基金會的Sanger研究所的合作項目，其網(wǎng)址是:http://www．ensembl．org［12，13］。Ensembl數(shù)據(jù)庫內(nèi)含有不斷更新的序列數(shù)據(jù)及真核細胞基因組自動產(chǎn)生的注釋數(shù)據(jù)，現(xiàn)已有包括人類、小鼠、大鼠、河豚、蚊子與蜥蜴在內(nèi)的40多個物種，其中心理念是將基因和其他豐富的注釋數(shù)據(jù)在參考基因組上以自動可視化的方法展現(xiàn)。Ensembl提供的豐富功能包括:①方便取得序列數(shù)據(jù);②已知基因的預(yù)測結(jié)構(gòu)以及其在基因組上的定位;③預(yù)測的基因和有關(guān)的支持證據(jù);④基因組生物特性的注釋數(shù)據(jù);⑤與國際上其他基因組資源的連接［12-13］。

2 利用miRBase獲得pre-miRNA及其側(cè)翼序列的詳細步驟

首先打開miRBase序列數(shù)據(jù)庫的主頁，在主頁右上方的搜索框內(nèi)輸入欲查詢miRNA的注冊號、名稱或關(guān)鍵詞，也可輸入?yún)⒖嘉墨I和注釋，然后點擊“Search”進行檢索;也可通過在“search by miRNA name or keywords”搜索框內(nèi)輸入miRNA名稱和關(guān)鍵詞，然后點擊“Go”來查詢。如果輸入的查詢信息模糊、不精確，搜索結(jié)果則包括的范圍廣，需要瀏覽這些結(jié)果找到欲查詢的miRNA;若輸入的查詢信息精確(如輸入規(guī)范的miRNA名稱)，則可直接搜索到欲查詢的miRNA(如圖1所示)。下面我們以人miRNA 21(hsamir-21)為例來詳細介紹如何利用miRBase獲得hsamir-21的pre-miRNA及其側(cè)翼的DNA序列。

圖1 miRBase數(shù)據(jù)庫中檢索miRNA

2．1 利用miRBase數(shù)據(jù)庫獲得pre-miRNA在Ensemble數(shù)據(jù)庫中的位置鏈接

圖2 hsa-mir-21在miRBase數(shù)據(jù)庫中的檢索結(jié)果

在“search by miRNA name or keywords”搜索框內(nèi)輸入hsa-mir-21，點擊“Go”或按回車鍵(如圖1所示)，則進入查詢結(jié)果頁面(圖2)，主要包括了4部分結(jié)果:“Stem-loop sequence hsa-mir-21”(即hsa-mir-21莖環(huán)/發(fā)卡序列)、“Mature sequence hsa-miR-21-5p”(即hsa-miR-21-5p成熟序列)、“Mature sequence hsa-miR-21-3p”(即 hsa-miR-21-3p 成熟序列)以及“References”(參考文獻)。在“Stem-loop sequence hsa-mir-21”部分除了包括注冊號、符號、描述、注釋、基因家族、莖環(huán)及其序列等信息外，還包括有hsa-mir-21莖環(huán)/發(fā)卡(即hsa-mir-21的pre-miRNA)鏈接到Ensemble數(shù)據(jù)庫的位置信息，即位于人17號染色體:57，916，627-57，920，698，如圖2 橢圓內(nèi)所示。

2．2 在Ensemble數(shù)據(jù)庫獲得pre-miRNA在基因組上的位置及堿基序列

點擊hsa-mir-21在基因組上的位置鏈接:chr17:57918627-57918698［+］，即可進入 Ensembl數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果頁面，最上端顯示的是17號染色體的整體結(jié)構(gòu)情況。在中間位置的“Region in detail”部分則更詳細地顯示 Chromosome 17:57，916，627-57，920，698區(qū)域內(nèi)的染色體帶及基因疊連群，其中矩形框標示的是包含hsa-mir-21莖環(huán)結(jié)構(gòu)所在的位置(如圖3所示)。用鼠標左鍵單擊“MIR21”，則可彈出一個注釋MIR21特征的小窗口“HGNC Symbol:MIR21”;該窗口記錄有基因號(“gene”)、位置(“l(fā)ocation”)、基因類型(gene type)、所在鏈(strand)、分析(analysis)和預(yù)測方法(prediction method)(如圖3所示)。用鼠標左鍵單擊“l(fā)ocation”后的超鏈接 Chromosome 17:57，918，627-57，918，698，則可詳細顯示其位置、堿基序列以及序列導(dǎo)出窗口按鈕等(如圖4所示)。

圖3 利用Ensemble數(shù)據(jù)庫獲得hsa-mir-21的注釋數(shù)據(jù)和其pre-miRNA在基因組上的位置鏈接

2．3 利用Ensemble數(shù)據(jù)庫獲得pre-miRNA及其側(cè)翼的DNA序列

圖4 利用Ensemble數(shù)據(jù)庫獲得hsa-mir-21的pre-miRNA的DNA序列及序列導(dǎo)出窗口按鈕

圖5 Ensemble數(shù)據(jù)庫中hsa-mir-21 pre-miRNA及其側(cè)翼序列導(dǎo)出窗口

點擊圖4左上方的“Export data”則可彈出“Export data”-設(shè)置窗口(如圖5所示):包括位置、序列格式、選擇的位置，最重要的是我們可以根據(jù)所需5＇和3＇側(cè)翼序列的長度、在5＇和3＇側(cè)翼序列輸入框內(nèi)填寫相應(yīng)的數(shù)字，設(shè)置的長度范圍為:0-1000000。如果在5＇和3＇側(cè)翼序列的長度輸入框內(nèi)填寫“0”，則導(dǎo)出的序列只是hsa-mir-21的pre-miRNA基因序列;如果在5＇和3＇側(cè)翼序列的長度輸入框內(nèi)填寫大于0小于1000000的數(shù)字，則導(dǎo)出的序列不但包含hsa-mir-21的pre-miRNA基因序列，還包括其相應(yīng)長度的5＇和3＇側(cè)翼的DNA序列。目前在構(gòu)建miRNA高表達載體時，會在其上下游各多擴增100-200bp的序列，以保證pre-miRNA剪切后能生成成熟miRNA［8］。例如:在hsa-mir-21的pre-miRNA“Export data”窗口的5＇及3＇側(cè)翼序列輸入框內(nèi)各填寫數(shù)字150，然后點擊“next”，彈出“Export data-Export Con-figuration-Output format”窗口，在此窗口內(nèi)列出了三種序列格式(HTML、Text和Compressed text)，根據(jù)自己的需要，單擊相應(yīng)序列格式的超鏈接，則可導(dǎo)出hsa-mir-21相應(yīng)序列格式的pre-miRNA及其5＇和3＇側(cè)翼長各為150堿基的DNA序列。

綜上所述，我們介紹了利用miRBase和Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得pre-miRNA及其側(cè)翼DNA序列的詳細步驟，這對miRNA高表達載體的成功構(gòu)建及其功能研究具有非常重要的意義。

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