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    施用根際有益微生物對盆栽紫花苜蓿土壤中微生物區(qū)系的影響

    2013-03-14 00:39:40石杰
    黑龍江科學(xué) 2013年3期
    關(guān)鍵詞:固氮菌根瘤菌硅酸鹽

    石杰

    (黑龍江省科學(xué)院大慶分院,黑龍江大慶 163319)

    紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一種多年生豆科牧草植物,根狀莖發(fā)達(dá),枝葉繁茂,能覆蓋地面、減少蒸發(fā)、保蓄水分,減輕地表沖刷。有資料顯示,2~4年生的紫花苜蓿植株每公頃每年可固氮150~450kg,根系腐爛后可增加土壤有機(jī)質(zhì),改善物理性狀,提高土壤肥力。我國北方干旱地區(qū)實(shí)行糧食作物與紫花苜蓿輪作,更有利于提高糧食產(chǎn)量[1]。

    根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria,簡稱PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根際、莖葉的一類可促進(jìn)植物生長的有益菌類[2,3]。根際有益細(xì)菌能夠促進(jìn)植物對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用,或者產(chǎn)生促進(jìn)植物生長的代謝物,甚至抑制有害微生物。固氮菌、解磷細(xì)菌、解鉀細(xì)菌是具有促進(jìn)植物生長的PGPR,是微生物肥料的核心,通過代謝可增加土壤中N、P、K及抗菌素、生長素含量,或促進(jìn)土壤中一些有效性低的營養(yǎng)性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,或兼有刺激植物的生長發(fā)育進(jìn)程及防治病蟲害作用。

    然而,微生物在根圈的定殖很大程度上依賴于作物根的分泌物和溢出物,因而植物會影響到根圈微生物的群落組成和定殖,而它們特定的分泌物又可以作為化學(xué)信號分子而同微生物相互作用。一般而言,土壤以其物化特性和存在的土著微生物群體這兩種方式來影響接種的微生物的定殖。同時(shí),土壤中存在的土著微生物群體可能已經(jīng)建立了穩(wěn)定的互作作用,這種互作作用又可能受到接種微生物添加的影響。已有研究表明,植物根圈土壤施入有益微生物后,可促進(jìn)或抑制某些微生物的生長,調(diào)節(jié)微生物區(qū)系,改善微生態(tài)環(huán)境,促進(jìn)植物生長。研究使用根際促生菌增加退化土壤的微生物活性,改變退化土壤的結(jié)構(gòu)組成,達(dá)到改良退化土壤的目的。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 供試植物

    “三得利”為美國引進(jìn)品種,購買自甘肅省草原總站草業(yè)中心(發(fā)芽率:85.4%)。

    1.1.2 供試菌株

    苜蓿根瘤菌菌株91522(Rhizobium meliloti 91522)[4];

    巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium,中國菌保中心菌株號ACCC 10008);

    聯(lián)合固氮菌(Associative-nitrogen-fixing Bacterium)[5];

    鉀細(xì)菌(Bacillus mucilaginosus,膠質(zhì)芽孢桿菌,西南大學(xué)微生物研究中心分離);

    纖維素分解菌菌株1306(Cellulose-Degradation Fungi 1306)[6]。

    1.1.3 培養(yǎng)基(液)

    根瘤菌采用改進(jìn)的YMA培養(yǎng)基(液),固氮培養(yǎng)基(液),硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基(液),牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(液),察氏培養(yǎng)基(液),高氏一號培養(yǎng)基。

    1.1.4 鈣溶液

    使用氯化鈣溶液配制成5mmol/L。

    1.1.5 試驗(yàn)土壤

    來源于西南大學(xué)水土保持實(shí)驗(yàn)室經(jīng)水土流失模擬試驗(yàn)所獲得的土壤,pH7.7,有機(jī)質(zhì)7.27g/kg,全氮0.537g/ kg,全磷0.506mg/kg,全鉀20.4g/kg,堿解氮40.3mg/kg,有效磷6.7mg/kg,速效鉀93.3mg/kg;細(xì)菌2.28 E+05 CFU/ gsoil,真菌4.00 E+02 CFU/gsoil,硅酸鹽細(xì)菌7.70 E+03 CFU/gsoil,固氮菌2.85 E+03 CFU/gsoil,根瘤菌6.00 E+ 01 CFU/gsoil,放線菌5.90 E+03 CFU/gsoil。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株的準(zhǔn)備

    取生長于斜面上的苜蓿根瘤菌株91522一支,用5 mL無菌水洗下菌體,取1 mL接種于100 mL中性YMA培養(yǎng)液中,28℃置恒溫震蕩器中培養(yǎng)約24~26 h,調(diào)節(jié)其OD600值約為1.0后經(jīng)4000 rpm 20 min收集菌體,重新懸浮于新鮮YMA液體培養(yǎng)基中,加1%羧甲基纖維素納溶液作為黏著劑[7],用于拌種。將巨大芽孢桿菌,聯(lián)合固氮菌,鉀細(xì)菌,纖維素分解菌菌株1306活化后培養(yǎng)其相應(yīng)的菌懸液。接種環(huán)接種,培養(yǎng)箱培養(yǎng)至各菌懸液活菌體濃度約為106個(gè)/mL。根據(jù)田間最大持水量,確定各處理的最大施菌量。

    1.2.2 紫花苜蓿種子的制備

    挑選均勻飽滿的健壯的苜蓿種子,于50℃~60℃水中浸泡0.5h,撈出,白天放在陽光下曝曬,夜間轉(zhuǎn)至陰涼處,并加水保持種子濕潤,當(dāng)大部分種子略有膨脹時(shí)用根瘤菌拌種。

    1.2.3 土壤性狀測定方法

    全氮:蒸餾法;

    堿解氮:擴(kuò)散法;

    全磷和有效磷:鉬藍(lán)比色法(660 nm比色);

    全鉀和有效鉀:火焰光度法(6400型火焰光度計(jì));

    有機(jī)質(zhì):重鉻酸鉀消煮法;

    交換性酸:滴定法;

    土壤微生物數(shù)量:稀釋平板法。

    1.2.4 盆栽管理

    1)苗期施鈣:苗期施鈣一次,施用5mmol/L CaCl2溶液均勻撒入各個(gè)盆栽。

    2)栽培管理:取風(fēng)干土樣過3mm篩,每盆精確裝入6kg土樣,澆透水放置一晚后播種,每盆五穴,每穴播六顆種子。栽培期間澆水、除雜草。待種子均發(fā)芽之后按設(shè)計(jì)方案施入巨大芽孢桿菌、固氮菌、鉀細(xì)菌菌懸液。每月同一天取樣一次,取樣后施入相應(yīng)的新菌懸液,空白處理只澆水。

    1.2.5 收后處理

    分別于種植紫花苜蓿后的第一個(gè)月,第二個(gè)月,第三個(gè)月和第五個(gè)月取土樣,測定其化學(xué)和生物變化。第五個(gè)月收獲植株,將進(jìn)入生殖生長的紫花苜蓿植株剪碎,拌入土中、施用相應(yīng)水平的纖維素分解菌菌懸液,原位土漚熟兩個(gè)月,其間定時(shí)加水,使土樣保持濕潤,之后,再次取樣進(jìn)行各個(gè)化學(xué)和微生物指標(biāo)的檢測。

    1.2.6 試驗(yàn)因子設(shè)計(jì)

    采用四因素三水平的L9(34)正交設(shè)計(jì)法(如表1),四因素分別是施用巨大芽孢桿菌(A)、聯(lián)合固氮菌(B)、硅酸鹽細(xì)菌(C)和纖維素分解菌(D),三個(gè)水平分別是:水平一是施用該菌株的滅菌的菌懸液15mL、水平二是使用該菌株的活體菌懸液15mL,水平三是使用該菌株的活體菌懸液30mL。共九個(gè)處理,重復(fù)三次。

    表1 正交設(shè)計(jì)方案L9(34)Tab.1 Orthogonal design L9(34)

    1.2.7 數(shù)據(jù)處理

    利用Excel、DPS統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖分析,LSD法作多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 施用固氮菌菌懸液對土壤微生物數(shù)量的影響

    如表2所示,測定的各個(gè)微生物數(shù)量指標(biāo)在每個(gè)采樣期均有穩(wěn)定增加。第一個(gè)月中,施用聯(lián)合固氮菌菌懸液比不施用對細(xì)菌、固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量有顯著增加的作用,其中施用30mL聯(lián)合固氮菌的菌懸液對細(xì)菌總數(shù)的提高影響達(dá)到了顯著水平(P<0.05),第二個(gè)月同樣達(dá)到了顯著水平,且比第一個(gè)月的細(xì)菌總數(shù)也有明顯提高,第三個(gè)月各個(gè)處理的細(xì)菌總數(shù)基本達(dá)到了正常的穩(wěn)定水平,這說明施用聯(lián)合固氮菌對退化土壤的細(xì)菌總數(shù)具有速效提高的作用。施用纖維素分解菌漚熟兩個(gè)月后施用了聯(lián)合固氮菌處理的細(xì)菌總數(shù)還處于兩個(gè)月前的水平,而不施用聯(lián)合固氮菌的處理則比漚熟前降低了一個(gè)多單位,這說明施用聯(lián)合固氮菌的菌懸液和滅菌的菌懸液對維持退化土壤的細(xì)菌總數(shù)的正常水平有重要作用。

    表2 施用固氮菌菌懸液對退化土樣微生物數(shù)量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.2 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Associative-nitrogen-fixing Bacterium(logCFU·g-1dry soil)

    2.2 施用巨大芽孢桿菌菌懸液對土壤微生物數(shù)量的影響

    如表3所示,測定的各個(gè)微生物數(shù)量指標(biāo)在每個(gè)采樣期均有穩(wěn)定增加。第一個(gè)月中,施用30mL巨大芽孢桿菌菌懸液對細(xì)菌總數(shù)的提高影響達(dá)到了顯著水平(P<0.05),施用15mL巨大芽孢桿菌菌懸液對固氮菌、根瘤菌、真菌數(shù)量的提高影響達(dá)到了顯著水平,施用滅菌的巨大芽孢桿菌菌懸液比活體菌懸液對提高退化土壤硅酸鹽細(xì)菌和放線菌的數(shù)量更有利。第二個(gè)月施用巨大芽孢桿菌菌懸液對各個(gè)微生物指標(biāo)的提高也有顯著作用。其中施用30mL巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤的細(xì)菌總數(shù)、固氮菌數(shù)量、根瘤菌數(shù)量的提高達(dá)到了顯著水平,施用15mL巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤放線菌、真菌數(shù)量的提高達(dá)到顯著水平。施用滅菌的巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量的提高有顯著作用。第三個(gè)月各個(gè)處理的微生物指標(biāo)基本達(dá)到了正常的穩(wěn)定水平,這說明施用巨大芽孢桿菌對退化土壤的微生物指標(biāo)有速效提高的作用。施用纖維素分解菌漚熟兩個(gè)月后施用了巨大芽孢桿菌處理的各微生物指標(biāo)還處于兩個(gè)月前的水平,而不施用聯(lián)合固氮菌的處理則比漚熟前有所降低,這說明施用巨大芽孢桿菌的菌懸液和滅菌的菌懸液對維持退化土壤的細(xì)菌總數(shù)的正常水平有重要作用。退化土壤各處理的硅酸鹽數(shù)量又降回到原樣的水平。

    表3 施用巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土樣微生物數(shù)量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.3 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Bacillus megaterium(logCFU·g-1dry soil)

    2.3 施用硅酸鹽細(xì)菌菌懸液對土壤微生物數(shù)量的影響

    如表4所示,測定的各個(gè)微生物數(shù)量指標(biāo)在每個(gè)采樣期均有穩(wěn)定增加。第一個(gè)月中,施用15mL和30mL硅酸鹽菌懸液對硅酸鹽細(xì)菌總數(shù)的提高影響達(dá)到了顯著水平(P<0.05),對其他微生物指標(biāo)沒有顯著影響。第二個(gè)月施用硅酸鹽細(xì)菌菌懸液對退化土壤細(xì)菌總數(shù)、固氮菌數(shù)量、根瘤菌數(shù)量、真菌數(shù)量的提高有顯著作用。第三個(gè)月各個(gè)處理的微生物指標(biāo)基本達(dá)到了正常的穩(wěn)定水平,這說明施用硅酸鹽細(xì)菌對退化土壤的微生物指標(biāo)有速效提高的作用。但放線菌和真菌數(shù)量在各處理之間有顯著差異。施用纖維素分解菌漚熟兩個(gè)月后施用了硅酸鹽細(xì)菌處理的個(gè)微生物指標(biāo)還處于兩個(gè)月前的水平,而不施用硅酸鹽細(xì)菌的處理則比漚熟前有所降低,這說明施用硅酸鹽細(xì)菌的菌懸液和滅菌的菌懸液對維持退化土壤的細(xì)菌總數(shù)的正常水平有重要作用。退化土壤各處理的硅酸鹽數(shù)量又降回到原樣的水平。

    表4 施用硅酸鹽細(xì)菌菌懸液對退化土樣微生物數(shù)量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.4 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Bacillus mucilaginosus(logCFU·g-1dry soil)

    2.4 施用纖維素分解菌菌懸液對土壤微生物數(shù)量的影響

    使用纖維素分解菌對保持退化土壤的細(xì)菌、固氮菌、根瘤菌放線菌和真菌數(shù)量有顯著作用。對硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量沒有較大影響(表5)。從表5可以看到固氮菌與纖維素分解菌的相互作用非常顯著,施用15mL纖維素分解菌菌懸液對保持固氮菌和根瘤菌數(shù)有顯著作用。

    表5 施用纖維素分解菌菌懸液對退化土樣微生物數(shù)量的影響(logCFU·g-1干土)Tab.5 Effects on the number of microorganism in the degradeted soil after adding Cellulose-Degradation Fungi(logCFU·g-1dry soil)

    2.5 各個(gè)微生物指標(biāo)的相關(guān)性研究

    對退化土樣中各個(gè)微生物指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系分析表明(表6),在沙化的退化土壤中固氮菌的數(shù)量越多,則細(xì)菌總數(shù)越多,即細(xì)菌總數(shù)與固氮菌數(shù)量成顯著相關(guān)關(guān)系,也就是說,促進(jìn)土壤固氮菌數(shù)量的提高有利于土壤中細(xì)菌總數(shù)的提高。退化土壤中根瘤菌數(shù)量與固氮菌數(shù)量也有顯著相關(guān)的關(guān)系,這與兩者的生長基質(zhì)相似有關(guān)。真菌和細(xì)菌總數(shù)、固氮菌數(shù)量和根瘤菌數(shù)量有一定的相關(guān),但不顯著。

    表6 施入根際有益微生物后退化土壤中各微生物指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系分析r0.05=0.632Tab.6 Analysis of the correlation among microbial indicators in degradation soil by using PGPR r0.05=0.632

    2.6 正交設(shè)計(jì)直觀分析

    如表7,通過對多個(gè)響應(yīng)指標(biāo)的飽和正交分析,可以看出:能夠提高細(xì)菌數(shù)量的組合是A1B1C3D2(字母代表因素,數(shù)字代表水平),能夠提高硅酸鹽數(shù)量的組合是A3B2C1D1,能夠提高固氮菌數(shù)量的組合是A1B2C1D2,能夠提高根瘤菌數(shù)量的組合是A2B2C2D3,能夠提高放線菌數(shù)量的組合是A2B2C2D1,能夠提高真菌數(shù)量的組合是A1B1C1D3。其中A1出現(xiàn)了3回,A2出現(xiàn)了2回,A3出現(xiàn)了1回,B1出現(xiàn)了2回,B2出現(xiàn)了4回,C1出現(xiàn)了3回,C2出現(xiàn)了2回,C3出現(xiàn)了1回,D1出現(xiàn)了2回,D2出現(xiàn)了2回,D3出現(xiàn)了2回。因此,本試驗(yàn)的主要因素是B,最好的水平是B2。也就是說使用聯(lián)合固氮菌對退化土壤各個(gè)微生物指標(biāo)的影響最大,其中施用2.5mL·kg-1的聯(lián)合固氮菌的處理對修復(fù)退化土壤的微生物區(qū)系效果最好。

    表7 正交設(shè)計(jì)直觀分析Tab.7 Analysis of orthogonal design and intuitive

    3 結(jié)論與討論

    對于因水土流失而造成養(yǎng)分流失、沙化和微生物活性下降的退化土壤,種植紫花苜蓿和施用根際有益微生物對退化土壤的微生物數(shù)量的提高是非常迅速的,且最后會維持一個(gè)動態(tài)的平衡,不會因再次加入根際有益微生物而再次增加。但施用的根際有益微生物的種類和數(shù)量不同對提高微生物數(shù)量的速度和維持退化土壤微生態(tài)平衡的力度是不同的。一般施用的根際有益微生物越多,退化土壤的細(xì)菌總數(shù)也增加得越快。施用30mL聯(lián)合固氮菌菌懸液在第一個(gè)月基本上就使退化土壤的細(xì)菌數(shù)量、固氮菌數(shù)量、硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最高值。而各個(gè)處理的根瘤菌、真菌數(shù)量則很快便達(dá)到穩(wěn)定值,甚至不到一個(gè)月。各個(gè)處理對退化土壤的放線菌數(shù)量影響不顯著??瞻滋幚淼母鱾€(gè)微生物指標(biāo)雖然隨后也達(dá)到了和其他處理相似的水平,但其形成的微生態(tài)系統(tǒng)非常容易被破壞,這從漚熟后退化土壤各個(gè)處理的微生物數(shù)量的變化可以看出。施用15mL巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤固氮菌數(shù)量、根瘤菌數(shù)量、真菌數(shù)量的迅速提高有顯著作用,施用滅過菌的巨大芽孢桿菌菌懸液對退化土壤的硅酸鹽細(xì)菌、放線菌數(shù)量的提高有顯著作用。施用15mL硅酸鹽細(xì)菌菌懸液可以在第一個(gè)月就迅速提高退化土壤的硅酸鹽細(xì)菌數(shù)量。施用硅酸鹽細(xì)菌對其他微生物指標(biāo)的作用多體現(xiàn)在種植紫花苜蓿兩個(gè)月后,一般施用了硅酸鹽細(xì)菌的都比空白處理好。漚熟后空白處理的微生物指標(biāo)多變低較多。施入纖維素分解菌對退化土壤的微生物生態(tài)的平衡沒有嚴(yán)重的破壞作用。

    對土樣中各個(gè)微生物指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系分析表明,土壤中固氮菌的數(shù)量越多,則細(xì)菌總數(shù)越多,即細(xì)菌總數(shù)與固氮菌數(shù)量成顯著相關(guān)關(guān)系,也就是說,促進(jìn)土壤固氮菌數(shù)量的提高有利于土壤中細(xì)菌總數(shù)的提高。退化土壤中根瘤菌數(shù)量與固氮菌數(shù)量也有顯著相關(guān)的關(guān)系,這與兩者的生長基質(zhì)相似有關(guān)。真菌和細(xì)菌總數(shù)、固氮菌數(shù)量和根瘤菌數(shù)量有一定的相關(guān),但不顯著。對本試驗(yàn)的正交設(shè)計(jì)的直觀分析表明,在研究中,施用聯(lián)合固氮菌對修復(fù)退化土樣有著更重要的作用。

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