大蒜莖盤不定芽離體培養(yǎng)的研究

王云云，高 宇，肖 宇，孫 力，徐浩然，聶 迪，張 興，宋淑敏

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319)

大蒜(Allium sativum L.)栽培歷史悠久，是一種藥、菜兼用的世界性蔬菜。大蒜主要靠鱗莖進(jìn)行無(wú)性繁殖。大蒜在長(zhǎng)期無(wú)性繁殖過(guò)程中，易感染多種病毒，造成種性退化。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行大蒜脫毒種苗繁育，不僅能脫除病毒，還可以提高大蒜繁殖效率，改進(jìn)繁殖方法，提高鱗莖產(chǎn)量和品質(zhì)。利用組織培養(yǎng)技術(shù)脫除大蒜病毒有兩種途徑:器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑［1］。其中器官發(fā)生途徑已有大量研究，目前已建立了以莖尖、根尖［2］、真葉、貯藏葉、莖盤切塊、花序軸頂端分生組織［3］、花藥和花原始體［4］等為外植體的多種大蒜組織培養(yǎng)再生體系。莖尖分生組織研究最多，從培養(yǎng)基的篩選到移栽馴化以及工廠化生產(chǎn)具有研究，但其增殖系數(shù)一般在3～5［5，6］，并且試驗(yàn)操作要求較高，培養(yǎng)難度大，需要較多的人力物力，使得其規(guī)?；a(chǎn)受到限制。繼而更多的研究轉(zhuǎn)向提高增殖率和保障脫毒率的研究中。熊正琴［7］，以花序軸為外植體，采用直接成苗途徑，研究了花序軸培養(yǎng)條件，結(jié)果表明，取未熟花莖的花序軸為外植體，其繁殖系數(shù)可高達(dá)76;王洪?。?］取生殖期大蒜花梗，通過(guò)愈傷組織間接誘導(dǎo)叢生芽獲得大量的再生植株。唐巧玲［9］以國(guó)內(nèi)4個(gè)大蒜栽培品種為材料，建立了以根為外植體的再生體系。馬雯［10］，以莖尖分生組織培養(yǎng)結(jié)合熱處理的方法脫除大蒜病毒，建立大蒜莖尖脫毒培養(yǎng)體系，并以新鮮的或低溫貯藏的蒜薹為外植體，研究了貯藏時(shí)間和植物生長(zhǎng)激素對(duì)花苞培養(yǎng)誘導(dǎo)形成氣生鱗莖的影響，以及氣生鱗莖大小、處理溫度和植物激素配比對(duì)氣生鱗莖的萌發(fā)率的影響，建立了莖尖脫毒培養(yǎng)體系和大蒜花苞誘導(dǎo)形成氣生鱗莖的技術(shù)條件。曾建軍［11］以大蒜莖盤為外植體進(jìn)行脫毒快繁，獲得芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。張素芝［12］研究了植物激素對(duì)大蒜莖盤組織培養(yǎng)指出，高濃度生長(zhǎng)素有利于大蒜愈傷組織誘導(dǎo)，但不利于分化，通過(guò)莖盤培養(yǎng)的增殖系數(shù)可達(dá)到7.5，但繼代次數(shù)的增加嚴(yán)重影響了染色體變異率。龍玉娟［13］以大蒜品種‘三月黃’花序軸為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，對(duì)其器官發(fā)生過(guò)程進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀察;以‘二水早蒜’、‘徐州白蒜’和‘金鄉(xiāng)大蒜’4個(gè)品種大蒜的胚性與非胚性愈傷組織為材料，進(jìn)行了形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)的觀察，并通過(guò)器官直接發(fā)生、愈傷組織和體胚發(fā)生3種再生方式，對(duì)4個(gè)品種大蒜的再生試管苗及試管鱗莖形成過(guò)程及植株生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，大蒜花序軸離體培養(yǎng)不經(jīng)過(guò)愈傷組織，通過(guò)器官直接發(fā)生途徑形成不定芽，其不定芽起源于大蒜花序軸維管組織韌皮部一側(cè)周圍的皮層薄壁細(xì)胞，屬于外起源，不定芽通過(guò)壯苗、生根培養(yǎng)可正常生根形成植株，如果轉(zhuǎn)接培養(yǎng)周期超過(guò)21d，鱗莖形成率可達(dá)90.56%。大蒜胚性愈傷組織表面光滑且有易分散的橢圓形顆粒，擁有多個(gè)連續(xù)分生中心;而非胚性愈傷組織表面有瘤狀突起，沒(méi)有多個(gè)連續(xù)的分生中心。愈傷組織途徑和體胚途徑的增殖系數(shù)較高，達(dá)9.27～20.11;器官直接發(fā)生途徑的試管鱗莖形成率較高，為20.11% ～43.55%;愈傷組織途徑和體胚途徑的試管鱗莖形成率在15%以下。張恩讓［14］在大蒜芽直接再生途徑和愈傷組織途徑再生植株的過(guò)程中體細(xì)胞無(wú)性系變異的發(fā)生規(guī)律的研究中指出，大蒜體細(xì)胞無(wú)性系變異主要發(fā)生在愈傷組織形成階段和愈傷組織繼代增殖過(guò)程中。供試的5個(gè)品種莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)直接生芽培養(yǎng)時(shí)，由于沒(méi)有經(jīng)歷愈傷組織階段，所以，在再生植株中，幾乎沒(méi)有檢測(cè)到染色體變異發(fā)生;而經(jīng)歷愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，再分化形成的再生植株均出現(xiàn)了高頻率的染色體變異，且染色體變異頻率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，說(shuō)明變異是在愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中依次出現(xiàn)并累加的。孟新亞［15］以中牟5號(hào)大蒜根尖為外植體，篩選出愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，獲得胚性愈傷懸浮系的培養(yǎng)條件。梁艷［16］對(duì)不同蔗糖濃度對(duì)阿城紫皮大蒜試管微鱗莖的形成和膨大的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，隨著蔗糖濃度的提高，大蒜試管微鱗莖形成被促進(jìn)，而鱗莖發(fā)生數(shù)呈下降趨勢(shì)。欒非時(shí)在1995年［17］，以黑龍江省阿城脫毒紫皮種蒜為試材，應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，探討利用花原始體進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)，其繁殖系數(shù)為3.1848，并且經(jīng)幼苗根尖染色體壓片、鏡檢，未發(fā)現(xiàn)有任何染色體變異。

綜上所述，通過(guò)莖尖分生組織直接誘導(dǎo)出芽的途徑，成苗速度較快，變異率低，有利于保持品種種性，脫毒率較高，但增殖系數(shù)小，操作要求高，不利于工廠化生產(chǎn);而通過(guò)誘導(dǎo)愈傷組織再生途徑，增殖系數(shù)高，但染色體變異率大，不利于保持品種種性;而體細(xì)胞胚再生途徑，增殖率高，但其鱗莖形成率低。因此，仍需探尋一種高增殖率，高脫毒率，低變異率，短繁殖周期的高效大蒜脫毒快繁的技術(shù)體系。

M.Ayabe［18，19］在利用大蒜莖盤脫毒的研究中指出，在莖盤培養(yǎng)過(guò)程中，莖盤表面會(huì)形成圓形突起，組織觀察發(fā)現(xiàn)，這些圓形突起在內(nèi)部細(xì)胞組織和結(jié)構(gòu)形成過(guò)程與大蒜蒜瓣芽尖形成過(guò)程相似，同時(shí)，在不定芽幼芽階段(＜1mm)是脫毒的。因此，本項(xiàng)目以莖盤誘導(dǎo)出的不定芽為外植體進(jìn)行快繁，以我國(guó)北方主栽大蒜品種為試驗(yàn)材料，解決我國(guó)北方省份大蒜快繁中增殖系數(shù)低，操作難度大等影響大蒜快繁產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)瓶頸，為大蒜脫毒快繁的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

阿城大蒜，從哈爾濱市阿城區(qū)購(gòu)買的當(dāng)年新蒜。

2 試驗(yàn)內(nèi)容與方法

2.1 試驗(yàn)材料的處理

將阿城大蒜剝掉蒜皮，將蒜瓣清洗干凈，除去多余的鱗莖，留有莖盤和5mm厚的鱗莖，用75%的酒精滅菌5min。在無(wú)菌條件下，去除多余的鱗莖，將莖盤切割成1mm厚的4個(gè)小塊，分別接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

2.2 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為 LS 培養(yǎng)基(Linsmaier E，Skoog F)［20］或MS培養(yǎng)基，含蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，pH 值5.8，培養(yǎng)于光照12h/d，光照度1 400lx，溫度25±2℃。

2.3 莖盤不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

莖盤的繁殖系數(shù)的計(jì)算均以每個(gè)蒜瓣的莖盤為單位。以LS為基本培養(yǎng)基，探討不同NAA和6－BA濃度對(duì)莖盤不定芽誘導(dǎo)的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)二因素三水平全部組合試驗(yàn)，NAA 和6 －BA 的濃度梯度為 0，0.1，0.5，每瓶培養(yǎng)基接種3塊莖盤，每個(gè)處理10瓶，培養(yǎng)15d后，統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)。

2.4 繼代培養(yǎng)

取莖盤上長(zhǎng)出的不定芽(1mm左右)，基部要帶一部分莖盤，接種到繼代培養(yǎng)基上。

基本培養(yǎng)基種類、6－BA和NAA組合對(duì)不定芽生長(zhǎng)和增殖的影響試驗(yàn):在MS和LS培養(yǎng)基中，保持6－BA和NAA 的濃度比例為 10∶1，設(shè)置 0.5∶0.05，1.0∶0.1，2.0∶0.2，3.0∶0.3，4 個(gè)水平。保持NAA 濃度為0.1 mg/L ，設(shè)置6 －BA 與 NAA 的濃度比為 2∶1，5∶1，10∶1 ，20∶1 ，30∶1 等 5 個(gè)水平，共28個(gè)處理，重復(fù)2次。每個(gè)處理30個(gè)不定芽，培養(yǎng)15d后測(cè)量苗高和統(tǒng)計(jì)苗數(shù)，計(jì)算增殖系數(shù)。

2.5 生根和試管微鱗莖培養(yǎng)

以莖盤不定芽為外植體的試管苗易于生根，因此，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，探討不同NAA、IAA和溫度對(duì)試管微鱗莖形成的影響，試驗(yàn)采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平設(shè)置見(jiàn)表1，共9個(gè)處理，重復(fù)3次。培養(yǎng)15d后統(tǒng)計(jì)生根率和鱗莖形成率。

表1 因素和水平Tab.1 Factors and levels

3 結(jié)果與討論

3.1 不同激素配比對(duì)莖盤不定芽誘導(dǎo)的影響

接種7d后，莖盤表呈現(xiàn)出疣狀突起，培養(yǎng)15d逐漸可觀察到生長(zhǎng)出來(lái)的不定芽(圖1)，通過(guò)不同生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配比試驗(yàn)可以看出(圖2)，高濃度的NAA和6－BA對(duì)不定芽的產(chǎn)生都有一定的抑制作用，通過(guò)對(duì)不定芽數(shù)的統(tǒng)計(jì)，LS+NAA0.0+6－BA0.1培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率最高，平均每塊莖盤可產(chǎn)生5.7個(gè)不定芽(圖2)，按每個(gè)莖盤分成4個(gè)小塊計(jì)算，增殖系數(shù)為22.8。

圖1 莖盤不定芽誘導(dǎo)Fig.1 Development of vitro shoots from a stem disc

雙因素方差分析表明6－BA濃度的增加對(duì)不定芽誘導(dǎo)率的影響不顯著(F＜Fcrit，P －value＞0.05)，而 NAA 濃度的增加則明顯抑制不定芽的產(chǎn)生(F＞Fcrit，P－value＜0.05)，這與 M.Ayabe［18］等的研究一致。

圖2 激素對(duì)莖盤不定芽誘導(dǎo)的影響Fig.2 Effect of phytohormone on development of in vitro shoots from a stem disc

3.2 不同激素水平對(duì)不定芽生長(zhǎng)的影響

由圖3可以看出，對(duì)不定芽生長(zhǎng)和增殖來(lái)看，在不同的激素濃度和配比下，均以LS培養(yǎng)基最宜，經(jīng)過(guò)方差分析表明，在6－BA和NAA的濃度比值不變的情況下，濃度的變化對(duì)不定芽的生長(zhǎng)和增殖沒(méi)有顯著影響(表3，F(xiàn)＜Fcrit，P－value＞0.05)，而不同培養(yǎng)基類型對(duì)不定芽的生長(zhǎng)和分化有顯著影響(表3，F(xiàn)＞Fcrit，P －value＜0.05)。從6－BA和NAA不同濃度配比試驗(yàn)中可以看出(圖3c，d)，隨著6－BA和NAA的濃度比值增大，不定芽的生長(zhǎng)和分化得到不同程度的促進(jìn)，增殖系數(shù)最高達(dá)到了4.56，但在試驗(yàn)中觀察以及后續(xù)的生根馴化中來(lái)看，增殖系數(shù)大于4和株高超過(guò)6cm的幼苗，往往生長(zhǎng)細(xì)弱，不利于后續(xù)的生根和微鱗莖的形成(圖4)，同時(shí)還需要進(jìn)行壯苗才能達(dá)到較高的馴化成活率，這樣雖然提高了增殖系數(shù)，但是延長(zhǎng)了快繁時(shí)間，降低了快繁效率。因而，綜合考慮從不定芽的生長(zhǎng)和增殖效果以及繁殖效率來(lái)看，LS培養(yǎng)基+6－BA2.0+NAA0.2組合最適合不定芽的繼代培養(yǎng)。

表2 激素水平對(duì)不定芽誘導(dǎo)的方差分析表Tab.2 Variance analysis of effect of phytohormone on development of shoots from a stem disc

3.3 不同溫度和激素水平對(duì)大蒜微鱗莖形成和生根的影響

圖3 不同培養(yǎng)基和6－BA、NAA組合對(duì)不定芽生長(zhǎng)和增殖的影響Fig.3 Effects of medium and combinations of 6 － BA and NAA on garlic plantlet growth and proliferation

表3 不同培養(yǎng)基類型和激素含量對(duì)不定芽的影響的方差分析Tab.3 Variance analysis of effects of medium and phytohormone on garlic plantlet growth

圖4 不定芽的繼代培養(yǎng)Fig.4 Successive transfer culture of garlic plantlet

經(jīng)過(guò)不同培養(yǎng)溫度和激素水平的處理，結(jié)果通過(guò)表4可以看出，相對(duì)于不添加激素的1/2MS培養(yǎng)基，添加一定量的激素均有促進(jìn)大蒜生根和微鱗莖形成的作用。由處理3、5、6、7和9可以看出，較高濃度的IAA可以促進(jìn)生根和微鱗莖的形成，而較高濃度的NAA則起不到促進(jìn)作用，因此，較高濃度的IAA和較低濃度的NAA組合利于生根和微鱗莖的形成。從大蒜微鱗莖的形成和生根效果來(lái)看，不同處理溫度對(duì)形成微鱗莖的影響要大于對(duì)生根的影響。在較高溫度下，有較高的生根率卻有較低的鱗莖形成率，隨著溫度的降低，生根率顯著下降，而鱗莖形成率顯著增高。培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，溫度較高時(shí)25℃ ～27℃，根更傾向于伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，而溫度較低時(shí)10℃ ～15℃，幼苗基部可形成大量叢生、短而壯的根，根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制，轉(zhuǎn)向形成微鱗莖(圖5)，而當(dāng)溫度小于10℃生根率有所下降，從而影響微鱗莖的形成，因此，綜合考慮溫度和激素的相互作用，以培養(yǎng)溫度10℃ ～15℃，NAA0.1+IAA0.5 處理為生根和誘導(dǎo)微鱗莖形成的最佳培養(yǎng)基。

4 結(jié)論

大蒜莖盤分生能力強(qiáng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量不定芽，是大蒜快繁的絕佳外植體。通過(guò)試驗(yàn)研究莖盤不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為L(zhǎng)S+6BA0.1，不定芽繼代的最佳培養(yǎng)基為L(zhǎng)S培養(yǎng)基+6－BA2.0+NAA0.2，不定芽繼代過(guò)程中，要控制增殖系數(shù)和株高，將繼代和壯苗結(jié)合成在一起完成，這樣不但提高了成活率還能大大縮短快繁時(shí)間。生根和誘導(dǎo)微鱗莖的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.1+IAA0.5，適當(dāng)?shù)牡蜏赜欣谖Ⅶ[莖的形成，但溫度過(guò)低會(huì)影響根的生長(zhǎng)，試驗(yàn)表明10℃ ～15℃的培養(yǎng)溫度，有利于試管微鱗莖的形成和生根。本研究綜合考慮快增殖系數(shù)、馴化成活率和快繁周期等快繁過(guò)程中的關(guān)鍵因素，從控制分化和徒長(zhǎng)的角度篩選最佳組合的培養(yǎng)基，有利于大蒜莖盤不定芽快繁技術(shù)的推廣應(yīng)用。

表4 不同激素水平處理對(duì)鱗莖形成和生根的影響Tab.4 Effect of phytohormone on rooting and bulb form

圖5 不同培養(yǎng)溫度處理下大蒜幼苗生根和微鱗莖的形成Fig.5 The rooting and bulb forming of garlic plantlet in different culture temperature

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