紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

何 平，韋正乙，孫 卉，邢少辰

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林 長春 130033)

紫花苜蓿(Medicagosativa)，屬于豆科苜蓿屬，是一種高蛋白，營養(yǎng)豐富的多年生優(yōu)質(zhì)牧草。我國栽培紫花苜蓿已有2000多年歷史，在各地均有分布，目前，紫花苜蓿在全球種植面積約為3×108hm2，而在我國種植面積約為2×107hm2[1]。作為世界上栽培時(shí)間最久、分布最廣的豆科牧草之一，紫花苜蓿因蛋白質(zhì)含量高(約占干物質(zhì)量的20%)、含多種礦物元素、維生素和碳水化合物豐富[2]以及能進(jìn)行生物固氮等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，具有很高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。紫花苜蓿的傳統(tǒng)育種方法是常規(guī)雜交、回交，所需周期較長，并且高度依賴種質(zhì)資源，制約了紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。Deak等[3]在1986年用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neomycin Phosphotransforase,NPT)基因nptII導(dǎo)入苜蓿，首次實(shí)現(xiàn)了苜蓿的轉(zhuǎn)基因操作，提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿對(duì)卡那霉素(Kanmycin,Kan)的抗性，證明了通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良紫花苜蓿的可行性。隨后對(duì)于紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因的研究越來越多。本研究圍繞抗非生物脅迫、抗生物脅迫、抗除草劑、品質(zhì)改良和植物生物反應(yīng)器5個(gè)主要方面將近年來關(guān)于紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因的研究進(jìn)行歸納整理，以期為相關(guān)研究提供有益幫助。

1 抗非生物脅迫

非生物脅迫主要包括干旱、寒冷、鹽堿、土壤中的離子和重金屬等因素[4]，是制約農(nóng)作物生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要原因。植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制[5]，因此，可以通過調(diào)節(jié)多個(gè)途徑中相關(guān)生物活性物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。作為世界上最主要的豆科牧草之一，品質(zhì)和產(chǎn)量是紫花苜蓿生產(chǎn)中的重要指標(biāo)，但其生長環(huán)境復(fù)雜，容易受到多種非生物脅迫的影響。因此，提高紫花苜蓿的抗逆水平，對(duì)于擴(kuò)大種植面積、提升品質(zhì)以及提高產(chǎn)量具有重要意義。

1.1抗鹽堿 土地鹽堿化是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因之一，也是制約農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素。目前世界上約20%的灌溉土地已經(jīng)受到鹽堿化的影響[6]，尤其在我國的華北、西北以及東北地區(qū)。紫花苜蓿的主要種植區(qū)域以鹽堿地為主[7]，土壤鹽堿化已經(jīng)嚴(yán)重影響了紫花苜蓿的產(chǎn)量，因此提高其抗鹽堿能力顯得尤為重要。

很多逆境脅迫應(yīng)答基因的啟動(dòng)子中都含有脫水應(yīng)答元件(Dehydration Responsive Element,DRE)和與之類似的C-重復(fù)序列(C-repeat,CRT)，它們對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用。脫水應(yīng)答元件結(jié)合因子(Dehydration Responsive Element Binding Factor,DREB)則能通過與DRE/CRT結(jié)合，進(jìn)而對(duì)逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用[8]。Jin等[9]將大豆(Glycinemax)中DREB的同源基因GmDREB1用擬南芥(Arabidopsisthaliana)Rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中進(jìn)行表達(dá)，試驗(yàn)結(jié)果表明，在200 mmol·L-1NaCl處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素?zé)晒庵?、游離脯氨酸含量和可溶性糖等生理指標(biāo)明顯高于非轉(zhuǎn)基因的野生型植株，表現(xiàn)出強(qiáng)的抗鹽性。劉艷芝等[10]已將DREB2A基因成功導(dǎo)入紫花苜?！肮r(nóng)1號(hào)”基因組中，T0代、T1代轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗逆能力，目前正在對(duì)獲得的T2代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗逆試驗(yàn)。

植物體內(nèi)的液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+Antiporter or Exchanger,NHX)是一種跨膜蛋白，它可以催化Na+和H+對(duì)液泡膜的橫跨交換，排除植物體內(nèi)多余的Na+，從而消除Na+的毒害作用，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)的pH值和Na+濃度具有重要作用[11]。Li等[12]從耐鹽植物蘇打豬毛菜(Salsolasoda)中分離出NHX的編碼基因SsNHX1，并將其轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，隨后對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因苜蓿2號(hào)、5號(hào)株系進(jìn)行抗鹽試驗(yàn)，NaCl的濃度選擇為0、100、200、300和400 mmol·L-1。轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗鹽能力，尤其是在400 mmol·L-1NaCl條件下生存超過了50 d，這是迄今為止報(bào)道的植物抗鹽性研究的最高水平。隨后Zhang等[13]也從小麥(Triticumaestivum)中克隆出TaNHX2基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，結(jié)果表明，在高鹽脅迫下T2代轉(zhuǎn)基因植株中受鹽誘導(dǎo)的酶活性高于野生型植株，當(dāng)NaCl濃度從100 mmol·L-1增加到200 mmol·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株中液泡膜Na+/H+逆向活動(dòng)率是野生型植株的2～3倍。Liu等[14]將具有表達(dá)堿蓬(Suaedacorniculata)NHX基因ScNHX1和液泡無機(jī)焦磷酸酶(H+-PPase)基因ScVP的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿進(jìn)行異花授粉，得到的ScVP/ScNHX1共表達(dá)植株在200 mmol·L-1NaCl和100 mmol·L-1NaHCO3處理下表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗鹽堿性。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室將來源于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的耐鹽基因HAL1(Halotolerance gene 1)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入紫花苜?！褒埬?03”。HAL1是較強(qiáng)的抗鹽基因，其表達(dá)的蛋白質(zhì)可以參與植物細(xì)胞對(duì)K+的吸收，維持細(xì)胞內(nèi)K+/Na+平衡，從而消除Na+毒害。外源基因HAL1的表達(dá)，使得最終獲得的轉(zhuǎn)基因植株能夠耐受住0.8%的NaCl脅迫，因此該基因顯著提高了受體紫花苜蓿的抗鹽能力[15]。

甜菜堿(Betaine)參與植物的滲透調(diào)節(jié)，可以在逆境脅迫下保護(hù)植物體內(nèi)的某些酶類，是一種優(yōu)良的滲透調(diào)節(jié)劑。甜菜堿醛脫氫酶(Betaine Aldehyde Dehydrogenase,BADH)是甜菜堿生物合成中的關(guān)鍵酶，可催化甜菜堿醛生成甜菜堿的反應(yīng)過程。Yan等[6]將BADH基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中表達(dá)并獲得了穩(wěn)定遺傳，轉(zhuǎn)基因植株在0.9%的NaCl條件下生長良好，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M植株則慢慢變黃、枯萎，最終死亡。

植物葉綠體中進(jìn)行的某些化學(xué)反應(yīng)和電子傳遞過程會(huì)產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)，若得不到及時(shí)清理就會(huì)通過Haber-Weiss反應(yīng)轉(zhuǎn)變成羥基自由基(·OH)，對(duì)植物具有毒害作用?？箟难?谷胱甘肽(Ascorbate-Glutathione,AsA-GSH)循環(huán)是植物清除H2O2的主要途徑，其中抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)是此途徑中的關(guān)鍵酶[16]。Guan等[17]將水稻(Oryzasativa)中APX的編碼基因OsAPx2克隆出來并在紫花苜蓿中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過NaCl處理7 d后，轉(zhuǎn)基因株系中H2O2含量明顯低于野生型對(duì)照組，并且APX的酶活力是對(duì)照組的2.89倍，證明其抗鹽水平明顯提高。

外源化合物在植物體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)很容易轉(zhuǎn)變成為高活性的中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物可以與植物體內(nèi)的某些生物大分子組分發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)植物造成危害。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-Transferase,GST)可以競(jìng)爭(zhēng)性地與這些產(chǎn)物結(jié)合，抑制其與其他生物大分子結(jié)合，起到解毒作用。Wang等[18]將野生大豆(G.soja)中的GST基因GsGST14轉(zhuǎn)入到紫花苜蓿中超量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株中GST的酶活力是野生型植株的1.73～1.99倍，在100 mmol·L-1的NaHCO3處理下可以正常生長，表明其對(duì)堿的抗性得到了增強(qiáng)。

上述研究主要通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方式將不同來源(大豆、擬南芥和蘇打豬毛菜等)、不同種類(轉(zhuǎn)錄因子DREB和功能蛋白APX、GST等)的外源抗鹽堿基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ斜磉_(dá)，試驗(yàn)結(jié)果均表明，這些外源基因的表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的抗鹽堿能力。張立全等[19]則將鹽生植物紅樹(Rhizophoraapiculata)總DNA利用花粉管通道法轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，并在隨后的試驗(yàn)中證明轉(zhuǎn)基因植株抗鹽能力得到提高[20]，為紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因研究提供了新的方法。

1.2抗低溫脅迫 低溫是導(dǎo)致紫花苜蓿減產(chǎn)的另一個(gè)重要原因。在低溫條件下，植物細(xì)胞會(huì)積累大量活性氧，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞膜和某些蛋白質(zhì)產(chǎn)生毒害作用，危害植物的正常生長，使植物減產(chǎn)，甚至死亡。一年種植，多年利用是紫花苜蓿的優(yōu)勢(shì)之一，所以增強(qiáng)其抗寒能力，提高其越冬率對(duì)于紫花苜蓿的增產(chǎn)和推廣非常重要。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一種含金屬酶類，可以通過催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，對(duì)植物體內(nèi)的氧自由基進(jìn)行清除，從而起到解毒作用。McKersie等[21]將擬南芥中Fe-SOD的cDNA置于花椰菜花葉病毒(Cauliflower Mosaic virus,CaMV)35S啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中超量表達(dá)，使該酶活性顯著提升。該試驗(yàn)雖然沒有降低低溫對(duì)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿葉片和須根的直接損傷，卻使轉(zhuǎn)基因植株的越冬率高出非轉(zhuǎn)基因組25%，可能是由于Fe-SOD對(duì)寒冷導(dǎo)致的次級(jí)傷害有抵抗作用，從而間接地提高了紫花苜蓿的越冬存活率。

CO2可在植物體內(nèi)ATP、多種酶和NADPH共同作用下轉(zhuǎn)化為蔗糖。作為植物光合作用的主要產(chǎn)物，蔗糖對(duì)植物的生長發(fā)育具有重要作用。蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase,SPS)是蔗糖合成過程中的關(guān)鍵酶。Shearer等[22]將經(jīng)過修飾的SPS基因置于CaMV35S啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，田間試驗(yàn)證明，SPS基因的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性。

目前針對(duì)抗低溫脅迫的紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因的研究報(bào)道較少，這可能是由于紫花苜蓿本身具有一定的耐寒能力，而提高紫花苜蓿的越冬能力對(duì)其推廣利用至關(guān)重要。上述研究已證實(shí)，導(dǎo)入抗寒基因可以提高紫花苜蓿的抗低溫能力，因此挖掘更多的抗寒基因資源將對(duì)今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)紫花苜蓿的抗寒能力提供幫助。

1.3抗干旱脅迫 干旱是農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中面臨的最主要威脅之一，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入抗旱基因是植物轉(zhuǎn)基因研究的一個(gè)熱點(diǎn)。紫花苜蓿作為重要的牧草，在我國西北地區(qū)約占栽培草地面積的80%[23]，因此提高其抗旱能力對(duì)提高其產(chǎn)量及維持生態(tài)環(huán)境意義重大。

Zhang等[24]從截型苜蓿(M.truncatula)中克隆出一種具有AP2結(jié)構(gòu)域的編碼基因WXP1并將其置于CaMV35S啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，結(jié)果證明，作為結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，WXP1的導(dǎo)入使轉(zhuǎn)基因植株葉片的蠟質(zhì)含量提高了29.6%～37.7%，從而抑制了植株在干旱條件下葉綠素和水分的流失，使植株抗旱、抗寒性得到了加強(qiáng)。隨后Jiang等[25]又將WXP1置于表皮特異性啟動(dòng)子CER6下轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，經(jīng)過3 d的水分脅迫和復(fù)水處理，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較高的凈光合效率、較高的相對(duì)含水量，并且能正常生長，植株的耐旱性得到了提高。

無機(jī)焦磷酸酶(H+-PPase)具有質(zhì)子泵作用，在植物受到逆境脅迫時(shí)可以在一定程度上維持植物體內(nèi)的離子平衡，降低離子毒害。Bao等[26]將擬南芥H+-PPase基因AVP1轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中進(jìn)行超量表達(dá)，所得的轉(zhuǎn)基因植株可以在缺水條件下生長良好，抗旱性得到了提高。

細(xì)胞分裂素(Cytokinin,CTK)是植物生長、發(fā)育過程中重要的激素類物質(zhì)，可以減弱植物葉片對(duì)干旱脅迫的敏感性。已發(fā)現(xiàn)在自然條件下生存的一些根瘤菌可以生成CTK。Xu等[27]將工程根瘤菌接種到紫花苜蓿植株上，而載體中的異戊烯基合成酶(Isopentency Transferas,IPT)基因ipt用不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株通過了高強(qiáng)度的干旱脅迫處理，相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M，大部分接種根瘤菌的轉(zhuǎn)ipt基因紫花苜蓿生存下來，并檢測(cè)到隨著其葉子中玉米素濃度小幅上升，抗氧化酶的表達(dá)也增強(qiáng)，表明合成更多的CTK提高了紫花苜蓿對(duì)干旱脅迫的耐受性。

鋅鐵調(diào)控蛋白(ZRT,IRT-like Protein,ZIP)是植物體內(nèi)重要的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)Fe2+、Ca2+及Zn2+等離子含量防止植物中毒。李燕等[28]克隆出紫花苜蓿ZIP基因MsZIP并導(dǎo)回紫花苜蓿中超表達(dá)，經(jīng)過25 μmol·L-1PEG-6000模擬干旱處理3 d，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱能力。

以上研究表明，通過導(dǎo)入外源基因提高紫花苜蓿抗旱性是一種可行、有效的方法，為紫花苜?？购敌杂N提供了新途徑。

1.4抗酸和鋁離子毒害 目前，世界上40%的耕地和70%的非農(nóng)業(yè)土地都具有較高酸性[29]，而在酸性土壤中，地殼中富含的鋁元素轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄訟l3+，直接作用于植物根部，抑制根部發(fā)育，影響其對(duì)水分和營養(yǎng)成分的吸收，并對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致植物減產(chǎn)甚至死亡。紫花苜蓿對(duì)土壤中的Al3+非常敏感，因此，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因方式提高紫花苜蓿對(duì)Al3+的耐受性是很重要的。

蘋果酸脫氫酶(Malate Dehydrogenase,MDH)可以催化草酰乙酸生成鋁離子螯合劑蘋果酸。Tesfaye等[30]用CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)苜蓿根瘤結(jié)節(jié)MDH基因neMDH在轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿中的表達(dá)，結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因植株中檸檬酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽和琥珀酸鹽的含量提高了4.2倍。在20 μmol·L-1AlCl3處理下，非轉(zhuǎn)基因植株已經(jīng)不能正常生長，而轉(zhuǎn)基因植株根系仍能正常生長，表明其對(duì)Al3+的抗性增強(qiáng)了。羅小英等[31]將neMDH轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中進(jìn)行超量表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因株系在耐鋁離子脅迫試驗(yàn)中根系的相對(duì)伸長量比非轉(zhuǎn)基因株系高出3.6%～22.5%，表現(xiàn)出對(duì)Al3+毒害更強(qiáng)的耐受性。

檸檬酸(Citric Acid)作為植物體內(nèi)重要的有機(jī)酸，在受到Al3+脅迫時(shí)可以與Al3+形成螯合物，從而消除Al3+對(duì)植物的毒害。Rosellini等[32]將檸檬酸合成過程中的關(guān)鍵酶檸檬酸合成酶(Citrate Synthase,CS)基因CS置于擬南芥Act2啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，通過鋁脅迫處理，轉(zhuǎn)基因苜蓿的體細(xì)胞胚根部能正常生長，經(jīng)過蘇木精染色表現(xiàn)為根尖處顏色變淺，這說明轉(zhuǎn)基因苜蓿對(duì)鋁的攝入量減少，提高了對(duì)鋁的耐受性。Barone等[33]將銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中CS基因連接在擬南芥Act2和煙草根特異性啟動(dòng)子RB7這兩個(gè)啟動(dòng)子下游并轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，所得的能表達(dá)CS基因的植株與野生型相比，具有對(duì)Al3+更強(qiáng)的抗性。

將生物螯合劑合成相關(guān)基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｊ悄壳巴ㄟ^轉(zhuǎn)基因技術(shù)關(guān)于紫花苜?？顾帷⒖逛X離子毒害的主要研究方向，以上研究證明這是提高紫花苜?？顾?、抗鋁離子毒害的有效途徑。

2 抗生物脅迫

蟲害和病害是生物脅迫的重要研究領(lǐng)域，這兩個(gè)方面也是影響植物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素。由于畜牧業(yè)迅速發(fā)展，紫花苜蓿的市場(chǎng)需求不斷增加，提高其抵御生物脅迫的能力，從而提高自身品質(zhì)和產(chǎn)量就顯得尤為重要。但是由于苜蓿本身具有較強(qiáng)的抗病、蟲性狀，且其生長環(huán)境惡劣導(dǎo)致病蟲不易集中爆發(fā)等原因，使得在這方面的研究不像玉米(Zeamays)、大豆以及水稻等作物那樣急迫。但是作為一種轉(zhuǎn)基因的模式植物，同時(shí)又是重要的牧草作物，往往在其他作物中進(jìn)行轉(zhuǎn)化的抗性基因要先在苜蓿中進(jìn)行功能驗(yàn)證試驗(yàn)，因此獲得了許多抗生物脅迫的苜蓿轉(zhuǎn)基因種質(zhì)資源。

2.1抗蟲性 蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)在孢芽形成時(shí)會(huì)生成一種毒性蛋白，稱為Bt毒蛋白。昆蟲腸道中的酶能將其分解成小的毒性多肽，從而麻痹昆蟲的消化系統(tǒng)，最后因腸道細(xì)胞壁損害導(dǎo)致昆蟲死亡。Strizhov等[34]將人工合成的Bt基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ?，試?yàn)結(jié)果顯示，Bt基因的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和?；页嵋苟?S.littoralis)的抗性。

蛋白酶抑制劑具有抵御植物蟲害的能力。Samac和Smigocki[35]將水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Oryzacystatin,OC)I基因OC-I和II基因OC-II轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，通過馬鈴薯(Solanumtuberosum)蛋白酶抑制劑II (Protease inhibitor II)啟動(dòng)子PinII控制這兩個(gè)基因的表達(dá)，并通過載體上攜帶的GUS基因研究它們的表達(dá)方式。試驗(yàn)結(jié)果顯示，通過GUS染色觀測(cè)到在轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿葉和根部GUS基因得到表達(dá)。接種根腐線蟲(Pratylenchusneglectus)導(dǎo)致GUS基因的局部表達(dá)，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比，轉(zhuǎn)入OC-I和OC-II的轉(zhuǎn)基因植株，根腐線蟲的種群數(shù)量分別下降了29%和32%。

2.2抗病性 植物受到病原微生物感染時(shí)會(huì)產(chǎn)生植保素(Phytoalexin,PA)，對(duì)植物自身起到防御作用。Hipskind和Paiva[36]將花生(Arachishypogaea)中白藜蘆醇合成酶(Resveratrol Synthase,RS)基因RS轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，產(chǎn)生了反式白藜蘆醇-3-o-β-D-吡喃葡糖苷(RGluc)。這一新化合物提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿對(duì)輪紋病(Phomamedicaginis)的抗性，并在一定程度上可以抑制病原孢子的形成。幾丁質(zhì)酶(Chitinase)廣泛用于對(duì)真菌病的防治，對(duì)于真菌病毒具有抑制作用。Mizukami和Houmura[37]將來源于水稻中的幾丁質(zhì)酶基因RCC2轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶的形成使轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿對(duì)絲核菌(Rhizoctoniaspp.)產(chǎn)生了抗性。Yang等[38]將截型葉苜蓿中一個(gè)持家基因RCT1克隆出來并轉(zhuǎn)化到紫花苜蓿中，大幅度增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)炭疽病(Colletotrichumspp.)的廣譜抗性。

雖然針對(duì)苜蓿本身病蟲害而選擇基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的案例不多，但現(xiàn)有的試驗(yàn)已為在苜蓿中開展遺傳轉(zhuǎn)化培育抗病、抗蟲轉(zhuǎn)基因新品種提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)和充足的理論依據(jù)。

3 抗除草劑

伴隨著農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)生產(chǎn)模式的轉(zhuǎn)變，除草劑得到了大面積的推廣和使用，但問題也隨之而來，除草劑對(duì)農(nóng)作物、牧草的生長同樣具有抑制，甚至致死作用。紫花苜蓿苗期生長較慢，而除草劑殘留期長，自然降解緩慢，為降低除草劑對(duì)紫花苜蓿生長的影響，通過轉(zhuǎn)基因方式提高其對(duì)除草劑的抗性是一條有效途徑。

作為廣譜除草劑，Basta的主要活性成分是草丁膦，又稱膦絲菌素，是一種有機(jī)膦類除草劑，其通過抑制谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,GS)的合成與生物活性，干擾氮代謝功能致使植物死亡。膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Phosphinthricin Acetyltransferase,PAT)對(duì)除草劑草丁膦具有解毒作用，劉艷芝等[39]將其編碼基因Bar通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式導(dǎo)入紫花苜蓿中，分子檢測(cè)證明Bar基因?qū)胱匣ㄜ俎；蚪M后，在5 mg·L-1Basta條件下，轉(zhuǎn)基因苜蓿能夠正常生長。

草甘膦也是一種廣譜性除草劑，使用量很大，它能競(jìng)爭(zhēng)性抑制植物體內(nèi)芳香族氨基酸的生物合成過程中關(guān)鍵酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase,EPSPs)的活性。孟山都公司將Epsps基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ?，田間試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)Epsps基因紫花苜蓿對(duì)除草劑草甘膦的抗性顯著增強(qiáng)[40]。

盡管除草劑基因本身的導(dǎo)入就能夠給紫花苜蓿的規(guī)模化種植管理帶來方便，但是在現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因發(fā)展中，其更多的是作為一種安全的篩選標(biāo)記基因服務(wù)于將其他外源基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿。伴隨著新型除草劑的出現(xiàn)和紫花苜?？剐曰蛳到y(tǒng)的開發(fā)，更多的抗除草劑轉(zhuǎn)基因苜蓿品種將被陸續(xù)報(bào)道。

4 品質(zhì)改良

含硫氨基酸、單寧和木質(zhì)素這3種化合物的含量是決定紫花苜蓿品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)。通過轉(zhuǎn)基因手段改變紫花苜蓿中這3種物質(zhì)的含量，可以達(dá)到改良紫花苜蓿品質(zhì)的目的。

紫花苜蓿中蛋白質(zhì)含量約占其干物質(zhì)量的20%[2]，但其中對(duì)牲畜質(zhì)量和產(chǎn)毛量具有重要作用的含硫氨基酸含量卻不多[41]，所以提高這些氨基酸的含量是改良紫花苜蓿品質(zhì)的一個(gè)重點(diǎn)。Avraham等[42]將擬南芥蛋氨酸合成途徑中調(diào)控第1個(gè)中間代謝物合成的關(guān)鍵酶胱硫醚Y合成酶(Cystathionine γ-Synthase,CGS)基因AtCGS的cDNA導(dǎo)入紫花苜蓿中，用擬南芥Rubisco小亞基啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。從試驗(yàn)所獲得的30個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中選出4個(gè)表達(dá)水平最高的株系進(jìn)行了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)這些株系中蛋氨酸、S-甲基蛋氨酸和甲硫氨酸的含量相對(duì)于野生型分別提高了32倍、19倍和2.2倍，游離的半胱氨酸、還原型谷胱甘肽和與蛋白質(zhì)結(jié)合的半胱氨酸含量分別提高了2.6倍、5.5倍和2.3倍。轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿中具有更高水平的蛋氨酸和半胱氨酸，改善了其品質(zhì)。Bagga等[41]將含硫氨基酸含量較多的玉米蛋白Zein的編碼基因構(gòu)建于CaMV35S啟動(dòng)子下，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，使轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的含硫氨基酸含量得到了提升。

由于紫花苜蓿中濃縮單寧(Condensed Tannins,CT)含量相對(duì)較少，單獨(dú)喂食紫花苜蓿鮮草會(huì)使家畜患臌脹病。因此，增加紫花苜蓿中CT含量，提高家畜的消化率是改良紫花苜蓿品質(zhì)的一個(gè)重要方向。Gruber等[43]將玉米花青素類化合物(包括CT)合成相關(guān)基因Lc轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)花青素的含量有所提高，其中CT含量也相應(yīng)增加。

木質(zhì)素(Lignin)含量與苜蓿細(xì)胞壁的硬度密切相關(guān)，但是過高的木質(zhì)素含量會(huì)影響動(dòng)物對(duì)紫花苜蓿的消化率。Jackson等[44]將反義基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，降低木質(zhì)素生物合成途徑中肉桂酰輔酶A還原酶(Cinnamoyl-CoA Reductase,CCR)和肉桂醇脫氫酶(Cinnamoyl Alcohol Dehydrogenas,CAD)的活性，使木質(zhì)素的生物合成受阻，從而導(dǎo)致葉片中的木質(zhì)素含量下降，提高了消化效率。Reddy等[45]通過轉(zhuǎn)基因手段降低了4-香豆酸-3-羥化酶(4-p-Coumarate 3-Hydroxylase,C3H)的含量，同樣降低了轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿中木質(zhì)素的含量，提高了其在動(dòng)物瘤胃中的消化率。Shadle等[46]則通過轉(zhuǎn)基因手段將轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿中莽草酸羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶(Shikimate Hydroxyeinnamoyhransferase,HCT)含量降低到野生型的15%～50%，木質(zhì)素的含量也明顯降低，消化率增加了20%。

紫花苜蓿作為一種重要的飼草其品質(zhì)好壞至關(guān)重要。以上這些研究都表明，利用一些合成過程中的關(guān)鍵酶來改善紫花苜蓿的品質(zhì)是目前主要的研究方向，利用轉(zhuǎn)基因的方法可以有效改良紫花苜蓿的品質(zhì)。無論是增強(qiáng)表達(dá)還是反義、干擾等沉默手段的介入，最終都是為紫花苜蓿通過代謝組學(xué)分析調(diào)節(jié)其代謝通路控制初生代謝、次生代謝產(chǎn)物積累達(dá)到改良的目的，相信隨著研究的不斷深入，將在轉(zhuǎn)錄因子和多基因?qū)雲(yún)f(xié)同調(diào)節(jié)代謝兩方面取得更多成果。

5 植物生物反應(yīng)器

利用天然或者人工改良過的植物細(xì)胞、組織和整株植株生產(chǎn)的具有重要生物功能的外源蛋白系統(tǒng)稱為植物生物反應(yīng)器。紫花苜蓿作為重要的牧草，本身不含有毒性物質(zhì)[47]，是生產(chǎn)植物可飼疫苗的理想材料。近年來以紫花苜蓿作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白也是一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。

Legocki等[48]將豬瘟病毒(Classical Wwime Fever Virus,CSFV)的E2糖蛋白基因E2和肝片吸蟲(Fasciolahepatica)的半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Protease)的編碼催化結(jié)構(gòu)域基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，用轉(zhuǎn)基因植株葉片喂養(yǎng)小鼠后檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答反應(yīng)。同樣地，將口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)的多聚蛋白基因P1和3C導(dǎo)入紫花苜蓿中進(jìn)行表達(dá)，檢測(cè)食用表達(dá)產(chǎn)物后的小鼠的免疫性時(shí)發(fā)現(xiàn)，受到病毒危害時(shí)，小鼠腸道內(nèi)發(fā)生了強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)[49]。Dong等[50]將密碼子優(yōu)化后的人A型輪狀病毒(Rotavirus,RV)VP6蛋白的編碼基因sVP6通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式整合到紫花苜?；蚪M中，轉(zhuǎn)基因苜蓿中VP6蛋白達(dá)到總可溶性蛋白的0.28%。每周用10 mg葉片提取物對(duì)雌性BALB/c小鼠進(jìn)行灌胃，檢測(cè)到小鼠具有高滴度的抗VP6血清IgG和粘膜IgA。用猴輪狀病毒(Simian Rotavirus,SA)感染小鼠幼崽，表明該處理有效減弱了病毒感染所引起的腹瀉癥狀。Lee等[51]將溶血性曼式桿菌(Mannheimiahaemolytica)A1型抗原GS60基因GS6054轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，經(jīng)過Western免疫印記分析，生產(chǎn)的抗原在干燥的轉(zhuǎn)基因材料中可以穩(wěn)定儲(chǔ)藏超過一年，飼喂兔子時(shí)也能激起粘膜免疫應(yīng)答，增強(qiáng)對(duì)巴氏德桿菌性肺炎(Pneumonicpasteurellosis)的免疫能力。上述試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿表達(dá)的產(chǎn)物能通過取食引起動(dòng)物腸胃的粘膜免疫應(yīng)答，是理想的生產(chǎn)植物可飼疫苗的生物反應(yīng)器。

Huang等[52]將禽呼腸孤病毒(Avian Reovirus,ARV)結(jié)構(gòu)蛋白S1中σC蛋白的編碼基因分別置于CaMV35S啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Actin)下游并分別轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中進(jìn)行表達(dá)，后期檢測(cè)顯示，在CaMV35S啟動(dòng)子和水稻Actin啟動(dòng)子調(diào)控下，轉(zhuǎn)基因株系中σC蛋白的最好表達(dá)水平分別占總可溶蛋白的0.008%和0.007%。試驗(yàn)表明，無論在轉(zhuǎn)化雙子葉植物常用的CaMV35S啟動(dòng)子還是單子葉植物常用的Actin啟動(dòng)子啟動(dòng)下，外源基因都可以被有效表達(dá)且表達(dá)量差異不大。

此外，Bellucci等[53]將一個(gè)融合蛋白Zeolin的基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)量為0.22～0.28 mg·g-1鮮葉。

上述這些證據(jù)均表明，紫花苜蓿適合表達(dá)外源蛋白，為今后用紫花苜蓿作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白打下了基礎(chǔ)。

6 存在的問題和展望

經(jīng)過20多年的研究與發(fā)展，紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因研究已經(jīng)取得很多成就(表1)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的體系也已經(jīng)基本成熟。許多抗性基因、藥用蛋白基因等已經(jīng)成功的在紫花苜蓿中得到表達(dá)，但是依然存在以下幾個(gè)方面的問題。

6.1基因沉默現(xiàn)象 目前對(duì)紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因的研究都是通過核轉(zhuǎn)化來對(duì)外源基因進(jìn)行表達(dá)，DNA甲基化、位置效應(yīng)等因素都可以引起基因沉默，導(dǎo)致外源基因表達(dá)量低或者得不到表達(dá)。目前所采用的應(yīng)對(duì)策略包括修飾外源基因消除甲基化的影響、修飾核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(Matrix Attachment Region,MAR)降低基因沉默概率等，但是這些方法所取得的效果并不顯著。因此，對(duì)基因沉默機(jī)制的研究還需要更加深入、系統(tǒng)，尋找更加有效的克服基因沉默的途徑，提高外源基因的表達(dá)水平。另外，本課題組在2011年首次實(shí)現(xiàn)了紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)化[52]，相比于核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，葉綠體轉(zhuǎn)化具有外源基因表達(dá)量高、沒有基因沉默現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)[53]，為今后紫花苜蓿作為生物反應(yīng)器開辟了一個(gè)新途徑。

6.2研究進(jìn)展不平衡 近些年紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因研究主要集中在抗非生物脅迫、植物反應(yīng)器、品質(zhì)改良這3個(gè)方面(表1)，而抗病蟲、抗除草劑的研究很少。多是針對(duì)單一性狀，導(dǎo)入單個(gè)基因，缺少多基因、大片段聯(lián)合性狀改良的研究，已有的報(bào)道大多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，真正進(jìn)入田間試驗(yàn)的研究很少，離商業(yè)化應(yīng)用還有很長的距離。因此，平衡各方面研究并加快研究進(jìn)程是本領(lǐng)域今后工作的重要任務(wù)。

表1 近年來紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因主要研究進(jìn)展Table 1 Advances in alfalfa genetic transformation in recent years

6.3轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的安全性問題 自轉(zhuǎn)基因技術(shù)問世以來，就存在著關(guān)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物是否安全的爭(zhēng)論，包括對(duì)人類、家畜和生態(tài)環(huán)境等的安全性。作為世界上廣泛種植的重要牧草，轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿是否安全同樣也引人關(guān)注。

在利用轉(zhuǎn)基因手段改良紫花苜蓿性狀的過程中，外源基因的表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，如抗蟲轉(zhuǎn)基因材料中會(huì)產(chǎn)生Bt毒蛋白，這種毒蛋白在家畜食用后能否被徹底降解？在農(nóng)牧產(chǎn)品中有無殘留？這些問題均是公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。截至目前，雖然研究并未發(fā)現(xiàn)外源基因的過表達(dá)對(duì)人類、家畜的健康產(chǎn)生威脅，但是進(jìn)一步完善轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿安全評(píng)價(jià)體系，更深入地研究外源基因表達(dá)產(chǎn)物在食用后的降解過程，廣泛深入地開展科普宣傳，有利于消除人們的顧慮，將對(duì)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的商業(yè)化推廣起到積極作用。

目前紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因研究中，篩選基因非常重要，通常采用抗性篩選基因從大量的非轉(zhuǎn)化體中篩選出少量的轉(zhuǎn)化事件。但是，篩選基因在篩選出轉(zhuǎn)化事件后就沒有繼續(xù)存在的價(jià)值，況且其表達(dá)的蛋白可能會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株自身產(chǎn)生不良影響。許多文獻(xiàn)在探索轉(zhuǎn)化完成后如何消除篩選標(biāo)記基因，目前常用的方法有共轉(zhuǎn)化[54]、轉(zhuǎn)座[55]、同源重組[56]和位點(diǎn)特異性重組[57]。但是紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因研究尚無此類報(bào)道，這應(yīng)該成為今后研究的一個(gè)重點(diǎn)。此外，使用安全性選擇標(biāo)記也提供了另外一條途徑，甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Mannose-6-Phosphate Isomerase,PMI)、木糖異構(gòu)酶(Xylose Isomerase,XI)等[58]是目前研究的主要安全性選擇標(biāo)記。

人類關(guān)注的另外一個(gè)問題是轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿是否會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成不良影響，因?yàn)樽匣ㄜ俎Ｗ越徊唤Y(jié)實(shí)，而常用的雜交、回交則加劇了基因漂移的幾率。由于絕大多數(shù)植物遵循細(xì)胞質(zhì)母性遺傳規(guī)律，花粉飄移的問題可以通過葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)得到有效控制，但遺憾的是，紫花苜蓿屬于少數(shù)的雙性遺傳物種，葉綠體基因同樣可以通過花粉傳播。目前主要通過分析其近緣植物種群，采取適當(dāng)措施進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，降低有可能存在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，如實(shí)行生殖隔離或者物理隔離種植等形式加以預(yù)防。

此外，當(dāng)前導(dǎo)入紫花苜蓿中的基因大多來源于微生物或草本植物，范圍較窄且主要是單一性狀，同時(shí)紫花苜蓿自身許多優(yōu)良基因資源有待于深入挖掘利用，尋找更優(yōu)良的基因資源將是今后紫花苜蓿遺傳改良的研究重點(diǎn)。如植物中的核因子Y(Nuclear Factor-Y,NF-Y)家族基因是近幾年研究轉(zhuǎn)基因植株抗逆的一個(gè)熱點(diǎn)基因家族，已被證實(shí)表達(dá)擬南芥[59]、玉米[61]中的NF-Y家族基因可以有效提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆能力，但是在紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因研究中尚未見報(bào)道，可能成為今后的一個(gè)研究熱點(diǎn)方向。本實(shí)驗(yàn)室已將紫花苜蓿中幾個(gè)NF-Y家族基因克隆出來并轉(zhuǎn)入到煙草和紫花苜蓿中，目前正在對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)。

紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因研究雖然已有20年之久，但與玉米、水稻、棉花(Gossypiumsp.)等主要農(nóng)作物相比，紫花苜蓿的轉(zhuǎn)基因研究起步較晚，研究深度和廣度也相對(duì)不足。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的不斷深入，將在紫花苜蓿重要農(nóng)藝性狀的遺傳改良和生物反應(yīng)器的研究與利用方面不斷發(fā)展。

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