HPLC法測定補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

劉富英 竇文淵 譚秀連

（1廣東省中醫(yī)院，廣州510120；2中國廣州分析測試中心廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣州510070）

HPLC法測定補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

劉富英1竇文淵2譚秀連1

（1廣東省中醫(yī)院，廣州510120；2中國廣州分析測試中心廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣州510070）

目的 建立HPLC法測定補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量的方法。方法采用WelchC18色譜柱（4.6mm×250nm，5μm），流動相：以水-乙腈進行梯度洗脫；檢測波長為260nm，流速為1.0ml／min，柱溫為35℃。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷在19.6～392μg／mL濃度范圍內峰面積與濃度呈良好線性關系（r＝0.9998，n＝6），平均加樣回收率為96.5%，RSD＝1.1%（n＝6）。結論本法簡便，結果準確，重現(xiàn)性好，可作為補中益氣丸的質量控制。

HPLC；補中益氣丸；毛蕊異黃酮葡萄糖苷

補中益氣丸，是由炙黃芪、黨參、炙甘草、白術（炒）、當歸、升麻、柴胡、陳皮共八味草藥加工而成的傳統(tǒng)中成藥，該成藥為棕褐色至黑褐色的小蜜丸或大蜜丸。功能與主治：補中益氣，升陽舉陷。用于脾胃虛弱、中氣下陷所致的體倦乏力、食少腹脹、便溏久瀉、肛門下墜［1］。研究表明黃芪異黃酮化合物對內皮細胞有保護作用［2］。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是2010年《中國藥典》中黃芪的新增的檢測成分，同時也是衡量黃芪質量的一個重要指標。黃芪是補中益氣丸處方中的君藥，因此，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量是補中益氣制劑一個重要的成分檢測指標。以往文獻報道毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定，主要是高效液相色譜法［3-10］，高效液相色譜法-串聯(lián)質譜法［11-12］，高效毛細管電泳二極管陣列法［13］，但未有文獻報道以HPLC測定補中益氣丸制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。因此，筆者采用HPLC測定補中益氣丸中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，為有效控制該制劑質量提供了依據(jù)。

1 儀器與試劑

日本島津LC-20AB液相色譜儀（包括二元梯度泵，自動進樣器，控溫箱，控制系統(tǒng)）；SPD-M20A PDA檢測器；島津LC solution色譜工作站。毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，≥98%）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck公司），水為高純水。樣品：補中益氣丸，由吉林修正集團股份有限公司生產，（規(guī)格：9g／粒，批號：20120201、20120202、20120203、20120301、20120302、20120303）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱WelchC18色譜柱（250×4.6mm，5μm）；流動相A：0.5%甲酸，流動相B：乙腈；梯度程序：0～10 min，10～40%B；10.1～20min，40～10%B.檢測波長：260nm；流速：1.0ml／min；柱溫：35℃；進樣量10μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品10.00mg，置25ml容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含毛蕊異黃酮葡萄糖苷392μg／ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取樣品20個，研細，混勻。取精密稱量約5.0g，加入重量1／2的硅藻土，混勻，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100ml，稱定重量，加熱回流4h，放冷，搖勻，濾過，精密量取過濾液50ml，回流溶劑至干，殘渣用甲醇定容至5ml，用濾膜過濾，配制成供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備按補中益氣丸處方比例，制成缺毛蕊異黃酮葡萄糖苷的陰性樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液配制方法配成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗對照溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液分別進樣10μl，按色譜條件進行測定，記錄色譜圖（見圖A、B、C）。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷不低于4000，供試品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰與前后峰分離度均大于1.5，且陰性樣品無干擾。

圖A 對照品高效液相色圖譜

圖B 供試品高效液相色圖譜

圖C 陰性樣品溶液高效液相色圖譜

2.4 線性關系試驗精密量取392μg／ml的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照溶液0.5，1.0，2.5，5.0，7.5ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度分別為19.6、39.2、98.0、196、288、392μg／ml的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照溶液，進樣10μl，按色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程A＝1916C＋8890，相關系數(shù)r＝0.9998（n＝6）。結果表明毛蕊異黃酮葡萄糖在19.6～392μg／ml濃度范圍內峰面積與濃度呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗取批號為“2.2.1”對照品溶液進樣10μl，按色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液峰面積的RSD＝0.72%（n＝6），表明此儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗取新配制的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24h進樣10μl，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積，結果RSD＝0.95%，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗精密稱取本品適量（批號：20120301），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積，計算含量RSD為0.85%（n＝6），表明此方法的重復性良好。

2.8 加樣回收試驗取同一批號（批號：20120301）的樣品6份，各精密加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結果，RSD＝0.70%，表明此方法準確可靠。見表1。

2.9 樣品含量測定取6個不同批次的樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以外標法計算含量（見表2），6批樣品的含量均≥0.1mg／g。

表1 加樣回收試驗測定結果（n＝6）

表2 樣品的含量測定結果

3 討論

以往高效液相測定毛蕊異黃酮葡萄糖的含量的文獻中，洗脫條件為等度和梯度洗脫，大多數(shù)色譜條件洗脫時間較長，筆者也嘗試過，發(fā)現(xiàn)補中益氣丸成分較多，等度洗脫不能滿足實驗要求，經過多次試驗，最后選擇0.5%甲酸水-乙腈作為流動相，進行梯度洗脫效果最理想。

通過SPD-M20A PDA檢測器對在190～800nm范圍進行掃描，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖對照品溶液和樣品圖譜，其中260nm處有較大吸收，因此，檢測波長選擇260nm。

炙黃芪為黃芪的炮制品，黃芪是豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的干燥根，在春節(jié)和秋季采挖。不同批次產品測出含量個別相差較大，分析原因可能是由于原材料蒙古黃芪或莢膜黃芪黃芪的干燥根采摘年限和季節(jié)的差異，以及黃芪生長環(huán)境影響。在一定年齡階段內，毛蕊異黃酮葡萄糖含量隨年齡增高而升高，在生長至6年左右時，毛蕊異黃酮葡萄糖含量達到最高，之后毛蕊異黃酮葡萄糖含量又開始下降。在同樣條件下，野生和園林的黃芪的毛蕊異黃酮葡萄糖含量明顯比種植的黃芪高，秋季花莖凋枯后是黃芪采摘的最好季節(jié)，因此，根據(jù)中藥特點去采摘才能更好利用中藥的寶貴資源。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）［S］．2010年版．北京：化學工業(yè)出版社，2010：780-781．

［2］宋瑞霞，余靜，梁連升，等．甘肅黃芪異黃酮化合物對血管內皮細胞凋亡的影響［J］．蘭州大學學報（醫(yī)學版），2007，3（33）：43-45．

［3］趙健雄，封士蘭，胡芳弟．中藥材黃芪與紅芪的色譜鑒別法［J］．分析測試技術與儀器，2005，11（1）：634-635．

［4］胡芳弟，封士蘭，趙健雄．中藥材紅芪中兩種異黃酮類成分的含量［J］．中藥材，2003，26（9）：46-49．

［5］羅春霞，林平川，谷麗華，等．高效液相色譜法測定黃芪中毛蕊異黃酮-7-O-β-P-葡萄吡喃糖苷的含量［J］．中國中藥雜志，2003，28（7）：603-605．

［6］宋健平，謝華．高效液相色譜法測定當歸補血滴丸中毛蕊異黃酮苷的含量［J］．中藥新藥與臨床藥理，2004，11，（15）：417-418．

［7］涂繼輝，賈凌云，孫啟時．蒙古黃芪中毛蕊異黃酮的分離及含量測定［J］．沈陽藥科大學學報，2006，23（11）：710-712．

［8］張軍，陳汀波，陳軍．HPLC同時測定補陽還陽湯中毛蕊異黃酮苷、芍藥苷、羥基紅花黃色素A的含量［J］．中藥新藥與臨床藥理，2009，20（4）：373-375．

［9］石子儀，鮑衷，姜勇，等．不同來源黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的定量分析［J］．中國中藥雜志，2007，32（9）：779-783．

［10］黃月純，尹雪，魏剛．玉屏風方飲片及湯劑中毛蕊異黃酮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量相關性研究［J］．中國實驗方劑學雜志，．2008，14（6）：6-9．

［11］李翔，朱臻宇，王彬，等．HPLC-MS測定黃芪藥材中3種成分的含量［J］．藥學學報，2006，41（8）：793-796．

［12］張曦，孫衍國，張峰，等．中藥黃芪中異黃酮苷類化合物的高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析［J］．精細化工，2005，22，：888-890．

［13］陳巧霞，韓樂，劉訓紅，等．HPCE同時測定黃芪飲品中3種指標成分的含量［J］．南京中醫(yī)藥大學學報，2012，28（3）：275-278．

Determination of Calycosin-7-glucoside in Buzhong Yiqi Pills by HPLC

L iu Fuying1Dou W enyuan2Tan Xiulian1
（1 Guangdong Hospital of Traditional Chinese M edicine,Guangdong Province,Guangzhou,510120,China；2 Guangdong Key Laboratory of Emergency Chemical Test,China National Analytical Center,Guangdong Province,Guangzhou,510070,China）

Objective To establish HPLC method for determination of BuzhongYiqi pills of Calycosin-7-glucoside content．MethodsWelch C18（4．6mm×250mm，5μm）was used，the mobile phase was a mixture of water-acetonitrile as mobile phase with gradient elution with the flow rate was 1.0ml／min，260nm as the decection wavelength and column temperature was 35℃．ResultsSalidroside showed good linear relationship at the range of 19.2μg／ml to 392μg／ml（r＝0.9998，n＝6）．The average recovery was 96.5%（n＝6），RSD＝0.97%（n＝6）．ConclusionThe method appeared to be simple，convenient and precise，and can be used for control of BuzhongYiqi Pills．

HPLC；BuzhongYiqi pills；Calycosin-7-glucoside

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.23.117

：1672-2779（2013）-23-0160-02

蘇 玲

2013-10-25）