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    Cyclin E和p53在膽囊癌組織中的表達及意義

    2013-03-09 05:13:33任培土
    關鍵詞:膽囊癌膽囊炎細胞周期

    任培土,傅 宏

    論著

    Cyclin E和p53在膽囊癌組織中的表達及意義

    任培土,傅 宏

    目的:探討p53和細胞周期蛋白E(Cyclin E)在膽囊癌組織中的表達及其意義。方法:采用免疫組化方法,檢測p53和Cyclin E在膽囊癌組織中的表達狀況,并以同期慢性膽囊炎組織作為對照。結果:p53和Cyclin E在膽囊癌組織中表達陽性率較慢性膽囊炎組高,在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率較高分化膽囊癌組織高,與腫瘤有無淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤1年生存率無明顯相關性;Cyclin E在晚期膽囊癌(Nevin III~V期)組織中表達陽性率較早期(Nevin I~II期)膽囊癌組織高,Cyclin E表達陽性的膽囊癌患者1年生存率較表達陰性者低(P<0.05)。結論:檢測分析p53和Cyclin E在膽囊組織中的表達,有助于對膽囊癌進行早期診斷和判斷預后。

    p53;細胞周期蛋白E;膽囊癌;免疫組織化學

    膽囊癌發(fā)現(xiàn)晚,預后差,治療效果不佳。隨著分子生物學的發(fā)展,人們的認識從解剖學的整體水平,擴展到以細胞生物學、免疫學、遺傳學為基礎的細胞水平、核酸和蛋白質(zhì)水平上。本研究通過同時檢測p53和細胞周期蛋白E(Cyclin E)在膽囊癌組織中的表達,為膽囊癌惡性程度和預后的判斷提供新的思路,進而探索有效治療措施。

    1 材料與方法

    1.1 病例選擇 隨機選擇2000年1月—2008年1月膽囊癌患者50例為研究對象,男21例,女29例;年齡34~81歲,平均64歲。選取同期慢性膽囊炎50例石蠟包埋的組織標本作為對照組,男23例,女27例;年齡32~80歲,平均60歲。準入標準:(1)臨床診斷為膽囊癌;(2)經(jīng)過手術,且存有石蠟包埋的組織標本。排除標準:(1)轉(zhuǎn)移性膽囊癌;(2)合并有其他惡性腫瘤。兩組基本資料比較,無統(tǒng)計學意義。

    1.2 p53和Cyclin E表達的檢測 采用EnVision TM、TRP/DAB,鼠/兔二步法染色。主要試劑:正常山羊血清購自博士德生物工程有限公司,一抗鼠抗人Cyclin E購自邁新公司,EnVision TM檢測試劑盒購自基因公司。

    結果判定:p53以鏡下觀察細胞核呈現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性細胞。采用雙盲法計陽性細胞。染色強度判定標準:未見褐色著色腫瘤細胞為(-),腫瘤細胞染色少于10%為弱陽性(+),10%~50%為中度陽性(++),50%以上為強陽性(+++)。Cyclin E以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至深棕色顆粒為陽性細胞,Cyclin E染色結果陰性(-)為陽性細胞率<5%,陽性(+)為陽性細胞率>5%。

    1.3 數(shù)據(jù)收集 收集p53和Cyclin E在不同組織中的表達,以及膽囊癌的病理類型、腫瘤分化程度、Nevin分期、是否轉(zhuǎn)移以及患者性別、年齡和預后。

    1.4 統(tǒng)計分析 對獲取的數(shù)據(jù)加以匯總,并進行統(tǒng)計分析,統(tǒng)計學處理計量資料均以均值±標準差表示,計量數(shù)據(jù)采用t檢驗,計數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗。以P<0.05為顯著性差異標準。

    2 結果

    兩組病人均檢測p53和Cyclin E在膽囊癌組織中的表達。p53在膽囊癌中的表達如圖1示;Cyclin E在膽囊癌中的表達如圖2示。

    圖1 p53在膽囊癌組織中表達(×200)

    圖2 Cyclin E在膽囊癌組織中表達(×200)

    2.1 p53在膽囊癌和膽囊炎組織中的表達 p53在膽囊癌組織中表達陽性率為64%(32/50),膽囊炎組織中陽性率為2%(1/50),兩者有顯著性差異(P<0.05)。p53在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率為78%(29/37),高分化膽囊癌組織中陽性率為23%(3/13),兩者有顯著性差異(P<0.05)。p53在早期(Nevin I~II期)膽囊癌組織中表達陽性率為64%(9/14),晚期膽囊癌(Nevin III~V期)組織中為64%(23/36),兩者無顯著性差異。p53在有淋巴或遠處轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中表達陽性率為61%(14/23),無轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中為67%(18/27),兩者無顯著性差異。50例膽囊癌中5例失訪。45例中p53陽性組的1年生存率為21%(6/29),p53陰性組為25%(4/16),兩者無顯著性差異。p53在不同病理類型膽囊癌中的表達因標本量較小,無法進行統(tǒng)計分析。

    2.2 Cyclin E在膽囊癌和膽囊炎組織中的表達Cyclin E在膽囊癌組織中表達陽性率為42%(21/50),膽囊炎組織中陽性率為6%(3/50),兩者有顯著性差異(P<0.05)。Cyclin E在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率為51%(19/37),高分化膽囊癌組織中陽性率為15%(2/13),兩者有顯著性差異(P<0.05)。Cyclin E在早期(Nevin I~II期)膽囊癌組織中表達陽性率為14%(2/14),晚期膽囊癌(Nevin III~V期)組織中為53%(19/36),兩者有顯著性差異(P<0.05)。Cyclin E在有淋巴或遠處轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中表達陽性率為43%(10/23),無轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中為41%(11/27),兩者無顯著性差異。50例膽囊癌5例失訪。45例中Cyclin E陽性組的1年生存率為3%(1/29),Cyclin E陰性組為56%(9/16),兩者有顯著性差異(P<0.05)。Cyclin E在不同病理類型膽囊癌中的表達因標本量較小,無法進行統(tǒng)計分析。

    3 討論

    膽囊癌的生物學性質(zhì)非常惡劣,容易發(fā)生局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移。加之起病隱匿,膽囊結石等在癥狀和體征上都對早期的膽囊癌有所掩飾,大部分膽囊癌在行剖腹探查時已經(jīng)發(fā)展到進展期,手術往往難以切除,且對化療、放療不敏感,預后差,總體治療效果不能令人滿意。盡管近年來影像學診斷技術有了明顯進步,但因該病的癥狀和體征缺乏特異性,確診時疾病多屬晚期。突破漿膜的晚期腫瘤,其生物學進程要比早期腫瘤快得多。不同惡性程度的腫瘤病人,其預后亦不同。因此,在臨床工作中會有不同的治療目的和思路,進而采取不同的治療措施。如何更好地判斷腫瘤的惡性程度和預后情況,從而為治療措施提供依據(jù),成為腫瘤工作者的目標。近幾年,國內(nèi)外學者對多種膽囊癌相關的分子生物學標記物如p53、Cyclin E等作了研究,圍繞這些分子標記物的結構、功能和彼此間的相互關系,來逐漸闡明膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸,為基因治療提供理論基礎。

    p53基因位于人染色體17p,長16~20 kb,有11個外顯子和l0個內(nèi)含子,編碼53 KD的核蛋白,有轉(zhuǎn)錄因子的特征,控制細胞的代謝,DNA的修復和合成,編排細胞的死亡。p53分為野生型和突變型。由于p53野生型蛋白的半衰期短,利用免疫組織化學只能檢測到突變型p53蛋白表達。p53基因是重要的腫瘤抑制基因,在體內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子,通過活化下游多種基因的表達,參與DNA損傷修復,又到細胞凋亡和分化,調(diào)控細胞周期和阻止細胞異常增殖。人類約50%以上的惡性腫瘤均有p53基因的異常改變。研究表明,膽囊癌中有較高頻率p53基因缺失和突變[1]。大多數(shù)學者認為,p53基因和膽囊癌的增殖、惡性程度和預后有關[2-3]。

    本研究結果顯示,膽囊癌組p53蛋白顯著高于膽囊炎組(P<0.05),提示p53基因突變與膽囊癌變密切相關,在原發(fā)性膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用。檢測p53蛋白有助于原發(fā)性膽囊癌的臨床診斷,并可作為膽囊的良性病變與惡性腫瘤相鑒別診斷的一個輔助指標。p53在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率較高分化膽囊癌組織高,且有顯著性差異??梢妏53的表達水平是判斷腫瘤組織分化程度的一個重要客觀指標,腫瘤細胞分化程度越低,p53陽性表達率越高,從而為判斷腫瘤的惡性程度提供了依據(jù)。

    本研究結果顯示,p53在早期(Nevin I~II期)膽囊癌組織和晚期膽囊癌(Nevin III~V期)組織中,表達無顯著性差異,與腫瘤有無轉(zhuǎn)移及腫瘤1年生存率無明顯相關性。提示p53的異常表達發(fā)生在膽囊癌的早期就存在,并且隨著腫瘤的發(fā)展將持續(xù)存在。因此,檢測p53的異常表達,有助于膽囊癌的早期診斷。

    細胞的增殖分裂是細胞最基本的生理活動,細胞的增殖分化依賴于細胞有序的周期活動。目前已明確,在細胞周期活動中存在調(diào)控點,控制細胞周期進展的速度。腫瘤的發(fā)生與細胞周期增殖調(diào)節(jié)失控有密切關系。到目前為止,發(fā)現(xiàn)的細胞周期蛋白(cyclin,亦稱之為循環(huán)素)有cyclin A、B、C、D、E、F、G、H等。Cyclin E是一類核蛋白,分子量約5×104,Cyclin E基因定位于19q12~13,有4個外顯子和3個內(nèi)含子。Cyclin E在細胞周期中呈明顯的周期性表達,正常情況下Cyclin E合成于G1中期,至G1晚期Gl~S交界處含量達高峰,隨后細胞進入S期。S期內(nèi)Cyclin E經(jīng)與“PEST”序列有關的蛋白分解或泛素化路徑降解而迅速下降,到G2/M期降為零。目前普遍認為G1期Cyclin E是原癌基因。

    本研究結果顯示,Cyclin E在膽囊癌組織中表達陽性率較膽囊炎組織高,在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率較高分化膽囊癌組織高,在晚期膽囊癌(Nevin III~V期)組織中表達陽性率較早期(Nevin I~II期)膽囊癌組織高,Cyclin E表達陽性者1年生存率較表達陰性者低,且有顯著性差異??梢奀yclin E在膽囊癌早期即有表達,且有Cyclin E陽性率越高腫瘤細胞分化程度越低、分期越晚、1年生存率越低的趨勢。Cyclin E的檢測解決了膽囊癌診治過程中的不少難題,早期表達有助于早期診斷,而在分化差、晚期和生存率的膽囊癌患者中的高表達,表明Cyclin E陽性表達程度高可能提示預后不良。Cyclin E的過表達可加速細胞增殖周期,促進膽囊癌細胞異常增殖,在膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。至于Cyclin E的過表達機制,目前尚未清楚。有人認為可能是由于DNA擴增所致。在沒有基因擴增的腫瘤患者中,轉(zhuǎn)錄水平的改變和信號傳導系統(tǒng)的上調(diào)與Cyclin E過表達有關。

    本研究表明,p53和Cyclin E的表達與膽囊組織的良惡性、組織分化程度、膽囊癌的Neivin分期以及預后有關。兩項指標結合分析,可更好地對膽囊癌進行早期診斷和判斷預后。Cyclin E是細胞周期正性調(diào)控因子,是細胞進人S期的關鍵性調(diào)節(jié)基因,而p53出現(xiàn)于細胞的G1晚期,調(diào)節(jié)細胞由G1期進人S期。p53和Cyclin E的表達在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展過程中,可能通過協(xié)同作用導致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。但腫瘤的發(fā)展涉及多種相關基因的調(diào)控,癌基因的激活和/或抑癌基因的失活均可誘發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。p53的表達與Cyclin E的表達之間是否通過共同途徑進而相互影響,其具體機制仍不十分明確,有待增加病例數(shù)進一步研究。

    [1]Parwani AV,Geradts J,Caspers E,et al.Immunohistochemical and genetic analysis of non-small cell and small cell gallbladder carcinoma and their precursor leisions[J].Mod Pathol,2003,16 (4):299-308.

    [2]Nagahashi M,Ajioka Y,Lang I,et al.Genetic changes of p53,K-ras,and microsatellite instability in gallbladder carcinoma in high-incidence areas of Japan and Hungary[J].World J Gastroen?terol.2008,14(1):70-75.

    [3]Wang SN,Chung SC,Tsai KB,et al.Aberrant p53 expression and the development of gallbaldder carcinoma and adenoma[J]. Kaohsiung J Med Sci,2006,22(2):53-59.

    (收稿:2012-12-26 修回:2013-04-08)

    (責任編輯 孔 棣)

    The Expression of p53 and Cyclin E in Gallbladder Carcinoma Tissues

    REN Pei-tu,FU Hong Depart?ment of Hepatobiliary Surgery of Shaoxing People’s Hospital,Shaoxing(312000),China

    ObjectiveTo explore the expression of p53 and Cyclin E in gallbladder carcinoma tissue and their significance.MethodsThe expression of p53 and Cyciln E in gallbladder carcinoma were detected by immunohistochemical technique and 50 cases of chronic cholecystitis tissues were collected as control.ResultsThe positive expression rate of p53 and Cyclin E was higher in gallbladder carcinoma than that in chronic chole?cystitis tissues.It was also higher in mid-low differerentiated gallbladder carcinoma than that in high differerenti?ated tissues.The expression of p53 had no significant difference between the early stage gallbladder carcinoma (Nevin I and II)and advanced stage(Nevin III-V)in while Cyclin E had.The lymphatic metastasis was not relat?ed with the expression of p53 and Cyclin E.The 1-year survival rate was not related with the expression of p53, but it was higher in patients whose Cyclin E were negative than positive ones.ConclusionAnalysis of expres?sion of p53 and Cyclin E is helpful to the early diagnosis and prognostic indication of gallbladder carcinoma.

    p53;Cyclin E;immunohistochemistry;gallbladder carcinoma

    R735.8

    A

    1007-6948(2013)05-0487-03

    10.3969/j.issn.1007-6948.2013.05.001

    浙江省紹興市人民醫(yī)院,浙江大學紹興醫(yī)院肝膽外科(紹興 312000)

    任培土,E-mail:sxrenpeitU@l63.com

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