Cyclin E和p53在膽囊癌組織中的表達及意義

任培土，傅 宏

論著

Cyclin E和p53在膽囊癌組織中的表達及意義

任培土，傅 宏

目的:探討p53和細胞周期蛋白E（Cyclin E）在膽囊癌組織中的表達及其意義。方法:采用免疫組化方法，檢測p53和Cyclin E在膽囊癌組織中的表達狀況，并以同期慢性膽囊炎組織作為對照。結果：p53和Cyclin E在膽囊癌組織中表達陽性率較慢性膽囊炎組高，在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率較高分化膽囊癌組織高，與腫瘤有無淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤1年生存率無明顯相關性；Cyclin E在晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中表達陽性率較早期（Nevin I～II期）膽囊癌組織高,Cyclin E表達陽性的膽囊癌患者1年生存率較表達陰性者低（P＜0.05）。結論:檢測分析p53和Cyclin E在膽囊組織中的表達，有助于對膽囊癌進行早期診斷和判斷預后。

p53；細胞周期蛋白E；膽囊癌；免疫組織化學

膽囊癌發(fā)現(xiàn)晚，預后差，治療效果不佳。隨著分子生物學的發(fā)展，人們的認識從解剖學的整體水平，擴展到以細胞生物學、免疫學、遺傳學為基礎的細胞水平、核酸和蛋白質(zhì)水平上。本研究通過同時檢測p53和細胞周期蛋白E（Cyclin E）在膽囊癌組織中的表達，為膽囊癌惡性程度和預后的判斷提供新的思路，進而探索有效治療措施。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 隨機選擇2000年1月—2008年1月膽囊癌患者50例為研究對象，男21例，女29例；年齡34～81歲，平均64歲。選取同期慢性膽囊炎50例石蠟包埋的組織標本作為對照組，男23例，女27例；年齡32～80歲，平均60歲。準入標準：（1）臨床診斷為膽囊癌；（2）經(jīng)過手術，且存有石蠟包埋的組織標本。排除標準：（1）轉(zhuǎn)移性膽囊癌；（2）合并有其他惡性腫瘤。兩組基本資料比較，無統(tǒng)計學意義。

1.2 p53和Cyclin E表達的檢測 采用EnVision TM、TRP/DAB，鼠/兔二步法染色。主要試劑：正常山羊血清購自博士德生物工程有限公司，一抗鼠抗人Cyclin E購自邁新公司，EnVision TM檢測試劑盒購自基因公司。

結果判定：p53以鏡下觀察細胞核呈現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性細胞。采用雙盲法計陽性細胞。染色強度判定標準：未見褐色著色腫瘤細胞為（-），腫瘤細胞染色少于10%為弱陽性（+），10%～50%為中度陽性（++），50%以上為強陽性（+++）。Cyclin E以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至深棕色顆粒為陽性細胞，Cyclin E染色結果陰性（-）為陽性細胞率＜5%，陽性（+）為陽性細胞率＞5%。

1.3 數(shù)據(jù)收集 收集p53和Cyclin E在不同組織中的表達，以及膽囊癌的病理類型、腫瘤分化程度、Nevin分期、是否轉(zhuǎn)移以及患者性別、年齡和預后。

1.4 統(tǒng)計分析 對獲取的數(shù)據(jù)加以匯總，并進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學處理計量資料均以均值±標準差表示，計量數(shù)據(jù)采用t檢驗，計數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗。以P＜0.05為顯著性差異標準。

2 結果

兩組病人均檢測p53和Cyclin E在膽囊癌組織中的表達。p53在膽囊癌中的表達如圖1示；Cyclin E在膽囊癌中的表達如圖2示。

圖1 p53在膽囊癌組織中表達（×200）

圖2 Cyclin E在膽囊癌組織中表達（×200）

2.1 p53在膽囊癌和膽囊炎組織中的表達 p53在膽囊癌組織中表達陽性率為64%(32/50)，膽囊炎組織中陽性率為2%(1/50)，兩者有顯著性差異（P＜0.05）。p53在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率為78%（29/37），高分化膽囊癌組織中陽性率為23%（3/13），兩者有顯著性差異（P＜0.05）。p53在早期（Nevin I～II期）膽囊癌組織中表達陽性率為64%（9/14），晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中為64%（23/36），兩者無顯著性差異。p53在有淋巴或遠處轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中表達陽性率為61%（14/23），無轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中為67%（18/27），兩者無顯著性差異。50例膽囊癌中5例失訪。45例中p53陽性組的1年生存率為21%（6/29），p53陰性組為25%（4/16），兩者無顯著性差異。p53在不同病理類型膽囊癌中的表達因標本量較小，無法進行統(tǒng)計分析。

2.2 Cyclin E在膽囊癌和膽囊炎組織中的表達Cyclin E在膽囊癌組織中表達陽性率為42%(21/50)，膽囊炎組織中陽性率為6%(3/50)，兩者有顯著性差異（P＜0.05）。Cyclin E在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率為51%（19/37），高分化膽囊癌組織中陽性率為15%（2/13），兩者有顯著性差異（P＜0.05）。Cyclin E在早期（Nevin I～II期）膽囊癌組織中表達陽性率為14%（2/14），晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中為53%（19/36），兩者有顯著性差異（P＜0.05）。Cyclin E在有淋巴或遠處轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中表達陽性率為43%（10/23），無轉(zhuǎn)移膽囊癌組織中為41%（11/27），兩者無顯著性差異。50例膽囊癌5例失訪。45例中Cyclin E陽性組的1年生存率為3%（1/29），Cyclin E陰性組為56%（9/16），兩者有顯著性差異（P＜0.05）。Cyclin E在不同病理類型膽囊癌中的表達因標本量較小，無法進行統(tǒng)計分析。

3 討論

膽囊癌的生物學性質(zhì)非常惡劣，容易發(fā)生局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移。加之起病隱匿，膽囊結石等在癥狀和體征上都對早期的膽囊癌有所掩飾，大部分膽囊癌在行剖腹探查時已經(jīng)發(fā)展到進展期，手術往往難以切除，且對化療、放療不敏感，預后差，總體治療效果不能令人滿意。盡管近年來影像學診斷技術有了明顯進步，但因該病的癥狀和體征缺乏特異性，確診時疾病多屬晚期。突破漿膜的晚期腫瘤，其生物學進程要比早期腫瘤快得多。不同惡性程度的腫瘤病人，其預后亦不同。因此，在臨床工作中會有不同的治療目的和思路，進而采取不同的治療措施。如何更好地判斷腫瘤的惡性程度和預后情況，從而為治療措施提供依據(jù)，成為腫瘤工作者的目標。近幾年，國內(nèi)外學者對多種膽囊癌相關的分子生物學標記物如p53、Cyclin E等作了研究，圍繞這些分子標記物的結構、功能和彼此間的相互關系，來逐漸闡明膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，為基因治療提供理論基礎。

p53基因位于人染色體17p，長16～20 kb，有11個外顯子和l0個內(nèi)含子，編碼53 KD的核蛋白，有轉(zhuǎn)錄因子的特征，控制細胞的代謝，DNA的修復和合成，編排細胞的死亡。p53分為野生型和突變型。由于p53野生型蛋白的半衰期短，利用免疫組織化學只能檢測到突變型p53蛋白表達。p53基因是重要的腫瘤抑制基因，在體內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子，通過活化下游多種基因的表達，參與DNA損傷修復，又到細胞凋亡和分化，調(diào)控細胞周期和阻止細胞異常增殖。人類約50%以上的惡性腫瘤均有p53基因的異常改變。研究表明，膽囊癌中有較高頻率p53基因缺失和突變[1]。大多數(shù)學者認為，p53基因和膽囊癌的增殖、惡性程度和預后有關[2-3]。

本研究結果顯示，膽囊癌組p53蛋白顯著高于膽囊炎組（P＜0.05），提示p53基因突變與膽囊癌變密切相關，在原發(fā)性膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用。檢測p53蛋白有助于原發(fā)性膽囊癌的臨床診斷，并可作為膽囊的良性病變與惡性腫瘤相鑒別診斷的一個輔助指標。p53在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率較高分化膽囊癌組織高，且有顯著性差異?？梢妏53的表達水平是判斷腫瘤組織分化程度的一個重要客觀指標，腫瘤細胞分化程度越低，p53陽性表達率越高，從而為判斷腫瘤的惡性程度提供了依據(jù)。

本研究結果顯示，p53在早期（Nevin I～II期）膽囊癌組織和晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中，表達無顯著性差異，與腫瘤有無轉(zhuǎn)移及腫瘤1年生存率無明顯相關性。提示p53的異常表達發(fā)生在膽囊癌的早期就存在，并且隨著腫瘤的發(fā)展將持續(xù)存在。因此，檢測p53的異常表達，有助于膽囊癌的早期診斷。

細胞的增殖分裂是細胞最基本的生理活動，細胞的增殖分化依賴于細胞有序的周期活動。目前已明確，在細胞周期活動中存在調(diào)控點，控制細胞周期進展的速度。腫瘤的發(fā)生與細胞周期增殖調(diào)節(jié)失控有密切關系。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的細胞周期蛋白(cyclin，亦稱之為循環(huán)素)有cyclin A、B、C、D、E、F、G、H等。Cyclin E是一類核蛋白，分子量約5×104，Cyclin E基因定位于19q12～13，有4個外顯子和3個內(nèi)含子。Cyclin E在細胞周期中呈明顯的周期性表達，正常情況下Cyclin E合成于G1中期，至G1晚期Gl～S交界處含量達高峰，隨后細胞進入S期。S期內(nèi)Cyclin E經(jīng)與“PEST”序列有關的蛋白分解或泛素化路徑降解而迅速下降，到G2/M期降為零。目前普遍認為G1期Cyclin E是原癌基因。

本研究結果顯示，Cyclin E在膽囊癌組織中表達陽性率較膽囊炎組織高，在中-低分化膽囊癌組織中表達陽性率較高分化膽囊癌組織高，在晚期膽囊癌（Nevin III～V期）組織中表達陽性率較早期（Nevin I～II期）膽囊癌組織高，Cyclin E表達陽性者1年生存率較表達陰性者低，且有顯著性差異?？梢奀yclin E在膽囊癌早期即有表達，且有Cyclin E陽性率越高腫瘤細胞分化程度越低、分期越晚、1年生存率越低的趨勢。Cyclin E的檢測解決了膽囊癌診治過程中的不少難題，早期表達有助于早期診斷，而在分化差、晚期和生存率的膽囊癌患者中的高表達，表明Cyclin E陽性表達程度高可能提示預后不良。Cyclin E的過表達可加速細胞增殖周期，促進膽囊癌細胞異常增殖，在膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。至于Cyclin E的過表達機制，目前尚未清楚。有人認為可能是由于DNA擴增所致。在沒有基因擴增的腫瘤患者中，轉(zhuǎn)錄水平的改變和信號傳導系統(tǒng)的上調(diào)與Cyclin E過表達有關。

本研究表明，p53和Cyclin E的表達與膽囊組織的良惡性、組織分化程度、膽囊癌的Neivin分期以及預后有關。兩項指標結合分析，可更好地對膽囊癌進行早期診斷和判斷預后。Cyclin E是細胞周期正性調(diào)控因子，是細胞進人S期的關鍵性調(diào)節(jié)基因，而p53出現(xiàn)于細胞的G1晚期，調(diào)節(jié)細胞由G1期進人S期。p53和Cyclin E的表達在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，可能通過協(xié)同作用導致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。但腫瘤的發(fā)展涉及多種相關基因的調(diào)控，癌基因的激活和/或抑癌基因的失活均可誘發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。p53的表達與Cyclin E的表達之間是否通過共同途徑進而相互影響，其具體機制仍不十分明確，有待增加病例數(shù)進一步研究。

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（收稿：2012-12-26 修回：2013-04-08）

（責任編輯 孔 棣）

The Expression of p53 and Cyclin E in Gallbladder Carcinoma Tissues

REN Pei-tu,FU Hong Depart?ment of Hepatobiliary Surgery of Shaoxing People’s Hospital,Shaoxing(312000),China

ObjectiveTo explore the expression of p53 and Cyclin E in gallbladder carcinoma tissue and their significance.MethodsThe expression of p53 and Cyciln E in gallbladder carcinoma were detected by immunohistochemical technique and 50 cases of chronic cholecystitis tissues were collected as control.ResultsThe positive expression rate of p53 and Cyclin E was higher in gallbladder carcinoma than that in chronic chole?cystitis tissues.It was also higher in mid-low differerentiated gallbladder carcinoma than that in high differerenti?ated tissues.The expression of p53 had no significant difference between the early stage gallbladder carcinoma (Nevin I and II)and advanced stage(Nevin III-V)in while Cyclin E had.The lymphatic metastasis was not relat?ed with the expression of p53 and Cyclin E.The 1-year survival rate was not related with the expression of p53, but it was higher in patients whose Cyclin E were negative than positive ones.ConclusionAnalysis of expres?sion of p53 and Cyclin E is helpful to the early diagnosis and prognostic indication of gallbladder carcinoma.

p53;Cyclin E;immunohistochemistry;gallbladder carcinoma

R735.8

A

1007-6948(2013)05-0487-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.05.001

浙江省紹興市人民醫(yī)院，浙江大學紹興醫(yī)院肝膽外科（紹興 312000）

任培土，E-mail：sxrenpeitU@l63.com