空間學習記憶訓練對大鼠海馬Caveolin-1蛋白表達的影響

嵇志紅，鄒 偉

（1.大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧師范大學 生命科學院，遼寧 大連 116029）

空間學習記憶訓練對大鼠海馬Caveolin-1蛋白表達的影響

嵇志紅1，鄒 偉2

（1.大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧師范大學 生命科學院，遼寧 大連 116029）

探討空間學習記憶訓練后大鼠海馬Caveolin-1（Cav-1）蛋白表達的變化。采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠的空間學習記憶能力，Western Blot方法檢測大鼠海馬Cav-1蛋白表達的變化。結(jié)果顯示：水迷宮實驗中，與青年訓練組比，老年訓練組大鼠的逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），穿臺次數(shù)明顯減少(P＜0.05)，在原平臺象限的停留時間明顯縮短(P＜0.05)。Western Blot檢測表明，與青年和老年對照組比，青年和老年水迷宮訓練組大鼠海馬Cav-1蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與青年對照組比，老年對照組大鼠海馬Cav-1蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與青年訓練組比，老年訓練組大鼠海馬Cav-1蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果提示Cav-1蛋白可能參與了空間學習記憶過程。

空間學習記憶；Caveolin-1蛋白；海馬

Caveolae是細胞質(zhì)膜上特殊的凹陷結(jié)構(gòu)（胞膜窖），含有豐富的膽固醇和鞘磷脂。Caveolin-1（Cav-1）是 Caveolae的主要結(jié)構(gòu)組分和標志蛋白，在膽固醇運輸、膜組裝、信號轉(zhuǎn)導和腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。研究表明，在胚胎發(fā)育過程中腦內(nèi)幾乎沒有Cav-1蛋白的表達，但生后Cav-1表達逐漸增加，成年后表達下調(diào)，表明Cav-1的表達與生后腦發(fā)育密切相關(guān)[3]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，Cav-1與腦功能的生理和病理變化有關(guān)，它影響神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生等過程[4-5]。有實驗表明，Y-迷宮分辨學習訓練后大鼠皮層內(nèi) Cav-1表達顯著升高，提示Cav-1可能在分辨學習記憶過程中起作用[6]。但目前為止，有關(guān)Cav-1是否參與空間學習記憶過程及其作用機制尚未見報道。本實驗采用 Morris水迷宮對青年和老年大鼠進行空間學習記憶訓練，通過Western blot檢測空間學習記憶訓練后Cav-1表達的變化，為探討Cav-1在空間學習記憶過程中的作用提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

3月齡（青年）與 18月齡（老年）健康雄性Spague-Dawley大鼠各16只，購于大連醫(yī)科大學SPF實驗動物中心。青年雄性大鼠隨機分為2組：青年對照組（YC），青年訓練組（YT）。老年大鼠也隨機分為2組：老年對照組（OC），老年訓練組（OT）。各組大鼠嚴格按飼養(yǎng)條件分籠飼養(yǎng)，標準鼠食，自由飲水，自然晝夜。

1.2 試劑與儀器

抗兔 caveolin-1（N-20）多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP-抗兔IgG與抗鼠actin單克隆抗體購自武漢博士德生物公司；ECLTM試劑購于美國Amersham Biosciences公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純。DMS-2型Morris水迷宮（中國醫(yī)學科學院藥物研究所）；全自動酶標儀（SUNRISE TECAN公司）；MV-Ⅱ型雙垂直板式電泳槽和PS-9型半干式轉(zhuǎn)移電泳儀（大連竟邁生物科技有限公司）；SuperT21離心機（美國索福公司）。

1.3 Morris水迷宮空間學習記憶訓練

共歷時6 d。前5 d進行定位航行試驗，隱蔽平臺置于東南象限中央水面下1 cm，每只大鼠每天訓練4次，每次120 s，兩次間隔20 min，儀器自動記錄從入水到找到隱蔽平臺并立于其上所需時間（逃避潛伏期），數(shù)據(jù)取4次均值。第6 d進行空間探索試驗，撤去平臺，然后在西北象限（原平臺對側(cè)象限）入水點將大鼠面向池壁放入水中，測定120 s內(nèi)在4個象限的游泳時間，其中東南象限（原平臺象限）的時間為記憶保持時間，同時記錄大鼠2 min內(nèi)穿過原平臺象限的次數(shù)。

1.4 Western blot分析

實驗結(jié)束后斷頭處死各組大鼠，冰上分離海馬，稱重后置于腦蛋白裂解液中，冰上勻漿裂解1～2 h，4℃冷凍離心機 10 000 r/min離心 15 min，取上清，Bradford法進行蛋白定量。制備 12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，取100 μg總蛋白上樣，電泳2 h；半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜30 min(PVDF膜)；5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h；Cav-1抗體(1：1000) 4℃孵育過夜，PBST漂洗3次，每次10 min；加入HRP-抗兔IgG(1：6000)室溫搖床中孵育1 h，PBST洗3次，每次5～10 min；ECL顯色，x光片曝光。凝膠成像系統(tǒng)對膠片進行薄層密度掃描，記錄相應(yīng)條帶的透射光積分光密度(IOD)值反映蛋白含量，β-actin 條帶作為內(nèi)參。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異用t檢驗，P〈0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 青年與老年大鼠空間學習記憶能力的變化

水迷宮定位航行實驗中，隨著訓練天數(shù)增加，青年組與老年組大鼠的逃避潛伏期均呈縮短趨勢，但青年組的逃避潛伏期在第4、第5天已明顯縮短，而老年組縮短的不明顯。與青年組大鼠相比較，除第二天外，其它天數(shù)老年組大鼠的逃避潛伏期均明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），尤以第4、第5天明顯（見表1）?？臻g探索試驗中，與青年組比，老年組大鼠的穿臺次數(shù)及在原平臺象限的停留時間均明顯少于青年組(P＜0.05)，而在對側(cè)平臺象限的停留時間無明顯差異。

表1 定位航行實驗中大鼠的逃避潛伏期（s）（n=8）

表2 空間探索試驗中大鼠的穿臺次數(shù)和象限停留時間（n=8）

2.2 空間學習記憶對海馬Cav-1蛋白表達的影響

為研究Cav-1蛋白在空間學習記憶中的作用，我們選擇青年大鼠（YT）和老年大鼠（OT）進行Morris水迷宮空間分辨學習訓練，以不訓練（只游泳不找平臺）的青年大鼠（YC）和老年大鼠（OC）作為對照。水迷宮訓練結(jié)束后，Western blot檢測了海馬 Cav-1蛋白的表達。結(jié)果表明，青年和老年水迷宮訓練組大鼠海馬內(nèi) Cav-1蛋白表達分別顯著高于青年和老年對照組海馬（P＜0.05），而且老年對照組大鼠海馬Cav-1蛋白表達顯著高于青年對照組（P＜0.01），老年訓練組大鼠海馬 Cav-1蛋白表達顯著高于青年訓練組（P＜0.01）。結(jié)果提示Cav-1蛋白可能參與了空間學習記憶過程（見圖1）。

圖1 空間學習記憶后海馬Caveolin-1蛋白表達

3 討論

學習和記憶是構(gòu)成人腦智能的要素。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸聯(lián)系的復雜性和可塑性是學習記憶的神經(jīng)生理學基礎(chǔ)，但其詳細機制目前尚不清楚。隨著增齡，大腦在神經(jīng)生理、生化及組織形態(tài)學等方面發(fā)生一系列退行性改變，即腦老化，臨床最突出的特征之一就是學習記憶能力減退。越來越多的證據(jù)表明腦老化與突觸可塑性的“丟失”有關(guān)[7-8]。突觸傳遞過程及突觸可塑性形成涉及許多蛋白參與。目前已知海馬內(nèi)與學習記憶信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的蛋白約有百余種，這些信號分子通過啟動細胞內(nèi)不同的信號通路，影響海馬突觸可塑性，在學習記憶及腦功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。Cav-1是細胞質(zhì)膜小窩的標志蛋白，近年來人們對Cav-1的研究主要集中在癌癥、心血管疾病、糖尿病、肌營養(yǎng)不良、炎癥反應(yīng)等方面，但最近發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有 Cav-1蛋白的表達，而且腦發(fā)育不同階段Cav-1蛋白的表達水平不同。也有研究表明在海馬神經(jīng)元軸突和樹突突起中有 Cav-1的表達，過量表達Cav-1的PC12細胞在損傷后伸出突起的數(shù)目增加[9]。這些研究表明，神經(jīng)細胞內(nèi)Cav-1的表達可能與突觸可塑性活動有關(guān)。

以往研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過 Y-迷宮學習訓練的青年大鼠海馬、前額葉皮層內(nèi)Cav-l蛋白的表達與未訓練大鼠比較，均有顯著增加[10]。由于海馬與空間記憶的形成密切相關(guān)，因此本實驗選用可以反應(yīng)空間學習記憶能力變化的 Morris水迷宮，作為行為訓練的實驗平臺。結(jié)果表明，與青年大鼠比，老年大鼠水迷宮實驗的逃避潛伏期明顯延長，穿臺次數(shù)明顯減少，在原平臺象限的停留時間明顯縮短，這些說明老年大鼠的空間學習記憶能力較差。進一步Western blot檢測表明，無論青年還是老年大鼠，Morris水迷宮訓練后海馬內(nèi)Cav-1的表達都顯著升高，這與我們以往的實驗結(jié)果一致，說明Cav-1參與了空間學習記憶過程，它的表達升高可能通過某種機制加強了突觸可塑性。另外本實驗還發(fā)現(xiàn)，老年大鼠海馬內(nèi)Cav-1表達要明顯高于青年大鼠，這似乎與其加強空間學習記憶能力相違背，但也可以這樣認為，由于老年大鼠的空間學習記憶能力減退，Cav-1表達增高可以作為一種代償機制。

綜上所述，Cav-1蛋白與空間學習記憶密切相關(guān)。至于 Cav-1參與空間學習記憶的機制及其信號轉(zhuǎn)導途徑，有待于后續(xù)實驗進一步研究。

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Effects of Spatial Learning-memory Training on Expression of Caveolin-1 in Rat Hippocampus

JI Zhi-hong1, ZOU Wei2
（1. Medical College of Dalian University, Dalian 116622, China; 2. College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China）

To investigate the effects of spatial learning-memory training on expression of Caveolin-1 in rat hippocampus. Spatial learning-memory ability was tested by Morris water maze test, and the expression of Caveolin-1 in hippocampus was examined by Western blot. Results showed that the escape latency in aged training group was significantly longer (P＜0.05, P＜0.01), The number of rats through the platform was significantly decreased (P＜0.05), and the time spent in the original quadrant that previously contained the platform was significantly shorter (P＜0.05), compared with the youth training group. Western blot showed the expression of Caveolin-1 in hippocampus of youth training and aged training group was significantly enhanced, compared with the youth and aged control group respectively (P＜0.05), and significantly enhanced in hippocampus of aged control group than youth control group (P＜0.01), and significantly enhanced in hippocampus of aged training group than youth training group (P＜0.01). The results suggest that Caveolin-1 might be involved in the process of spatial learning and memory.

spatial learning-memory; Caveolin-1 protein; hippocampus

R741

：A

：1008-2395(2013)06-0035-03

2013-10-15

國家自然科學基金資助項目(30970353)。

嵇志紅（1964-），女，副教授，研究方向：神經(jīng)生物學。