美洲黑石斑精子超低溫保存研究

劉洪軍, 官曙光, 劉清華, 李 軍, 于道德

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

美洲黑石斑精子超低溫保存研究

劉洪軍1, 官曙光1, 劉清華2, 李 軍2, 于道德1

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

作者采用2 mL的冷存管和程序降溫儀高效超低溫保存美洲黑石斑(Centropristis striataL.)精子。分析比較了 4種不同濃度抗凍劑 15%DMSO(二甲基亞砜)、15%EG(乙二醇)、15%PG(丙二醇)和 10% Meth(甲醇), 5種降溫速率(10, 15, 20, 25, 30℃/min)和5種解凍溫度(30, 35, 40, 45, 50℃)對(duì)美洲黑石斑精子超低溫保存效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 采用Hanks’作為稀釋液, 15% DMSO、15% EG、15% PG作為抗凍劑, 30 ℃/min的降溫速率對(duì)精液進(jìn)行超低溫保存35 ℃水浴解凍, 凍精激活后獲得理想的運(yùn)動(dòng)率(＞60%)。通過(guò)對(duì)抗凍劑、降溫速率、解凍溫度的篩選, 作者建立了美洲黑石斑精液高效超低溫保存的方法, 并對(duì)凍精進(jìn)行長(zhǎng)期保存。美洲黑石斑精子超低溫保存方法的建立對(duì)于海水魚(yú)類精子庫(kù)的建立以及種質(zhì)資源的保存和生物多樣性的保護(hù)具有重要意義。

美洲黑石斑(Centropristis striataL.); 精子低溫保存; 抗凍劑; 精子活力

超低溫冷凍保存是種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的一個(gè)重要方法。超低溫保存的樣品可進(jìn)行長(zhǎng)距離的運(yùn)輸, 實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交、異源精子雌核發(fā)育誘導(dǎo); 同時(shí)將精子超低溫保存還可以提高精子的利用率, 減少雄性親魚(yú)培育數(shù)量, 降低成本; 通過(guò)建立精子庫(kù)對(duì)精液進(jìn)行長(zhǎng)期保存對(duì)種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義, 可以使瀕臨滅絕的物種的種質(zhì)細(xì)胞得以長(zhǎng)期的保存, 待需要時(shí)解凍來(lái)恢復(fù)其資源結(jié)構(gòu)[1-5]。自從 1953年 Blaxter成功冷凍保存大西洋鯡魚(yú)(Clupea harengus)精巢[6]以來(lái), 魚(yú)類種質(zhì)細(xì)胞的低溫保存迅速發(fā)展起來(lái), 在過(guò)去的50多年中, 世界許多國(guó)家的科研工作者圍繞超低溫保存的降溫方法、抗凍液的篩選、冷凍、解凍速率等方面開(kāi)展了大量的研究工作, 并取得了巨大的進(jìn)展, 現(xiàn)已有 200多種魚(yú)的精液被成功地超低溫保存起來(lái), 其中有40多種海水魚(yú)的精液已進(jìn)行了成功的超低溫保存研究[7]。中國(guó)隨著海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的迫切需要以及對(duì)海洋種質(zhì)資源保護(hù)的認(rèn)識(shí), 海洋魚(yú)類精液的超低溫保存取得了巨大的進(jìn)展, 對(duì)于一些具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚(yú)類的精液如真鯛(Pagrus major)[8-12]、黑鯛(Sparus macrocephlus)[13]、大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)[14]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[15]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[16]、鱸魚(yú)(Lateolabrax japonicus)[17]進(jìn)行了成功的超低溫保存研究。

美洲黑石斑(Centropristis striataL.)屬于鮨科(Serranidae), 石斑魚(yú)亞科(Serraninae), 俗名有翡翠斑、珍珠斑等美譽(yù), 屬于目前國(guó)際上養(yǎng)殖的石斑魚(yú)類之一, 中國(guó)于2003年成功引進(jìn)[18]。黑石斑魚(yú)屬于雌雄同體, 首先發(fā)育為卵巢, 至第3～5年精巢開(kāi)始發(fā)育產(chǎn)生精子。因此黑石斑魚(yú)先雌后雄的繁育特性, 給人工繁育帶來(lái)了困難。因此為了使得精子、卵子同步獲得, 作者采用了超低溫冷凍保存的方法首先將精子凍存, 然后等待卵子的成熟。目前雖然國(guó)外黑石斑精子已有報(bào)到[19], 但是僅限于小體積0.5 mL麥管保存, 保存量遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)使用。

本研究中作者擬采用2 mL的凍存管、程序降溫法、分析了4種抗凍劑、5種降溫速率和5種解凍溫度對(duì)美洲黑石斑精子超低溫保存的影響。采用程序降溫法, 進(jìn)行大容量冷凍保存, 建立一種黑石斑魚(yú)精子實(shí)用型冷凍保存方法。建立美洲黑石斑精子超低溫保存的方法可以減少雄性親魚(yú)的養(yǎng)殖量, 從而減少養(yǎng)殖成本, 同時(shí)對(duì)于石斑魚(yú)其他種類精子超低溫保存方法的建立具有重要的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 精子采集

材料采于2011年采集美洲黑石斑性成熟盛期(3月中旬至 5月下旬), 成熟的親魚(yú)養(yǎng)殖于煙臺(tái)市百佳水產(chǎn)公司(龍口, 黃山館養(yǎng)殖基地)。10尾雌魚(yú)和 20尾雄魚(yú)(3～4 kg, 6～7 齡)暫養(yǎng)于20 m3水池中, 循環(huán)海水。精子采集前雄魚(yú)首先置于0.003% 的丁香酚溶液中麻醉, 然后取出將魚(yú)體用蒸餾水沖洗、擦干, 輕輕擠壓腹部采集精液于玻璃器皿中, 采集過(guò)程中注意海水、血液、糞便的污染。收集的精子立即進(jìn)行鏡檢, 活力較高的精子進(jìn)行下面的試驗(yàn)。

1.2 抗凍劑的篩選

將精液與Hanks’液(NaCl 8.01 g/L; KCl 0.40 g/L; CaCl20.14 g/L; NaHCO30.35 g/L; KH2PO40.06 g/L; MgCl·6H2O 0.10 g/L; MgSO4·7H2O 0.10 g/L; Na2HPO4·2H2O 0.06 g/L; Glucose 10.00 g/L; pH 6.80)稀釋的不同種類不同濃度的抗凍劑: 二甲基亞砜 (DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇 (PG)、甲醇(Meth) 以1∶3(v/v)的比例混合后, 將混合液吸入2 mL的冷存管中, 然后將冷存管轉(zhuǎn)入Kryo-360-1.7程序降溫儀, 0 ℃平衡2 min,置于程序降溫儀中, 平衡, 然后以 20 ℃/min 的速度降至–180℃并停留2 min, 然后轉(zhuǎn)入液氮保存。保存一定的時(shí)間然后解凍激活, 計(jì)算精子的運(yùn)動(dòng)率。實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)率的計(jì)算是采用精子激活后視野中運(yùn)動(dòng)的精子占所有精子的百分比, 一個(gè)樣品取3個(gè)視野, 一個(gè)視野精子數(shù)不低于100個(gè)。

1.3 降溫速率的篩選

將精液與Hanks’液稀釋的DMSO以1:3的比例混合后, 0 ℃平衡 2 min, 置于程序降溫儀中平衡, 然后以10、15、20、25、30℃/min 的速度降至–180℃并停留2 min, 然后轉(zhuǎn)入液氮保存。4個(gè)月后以35℃水浴解凍計(jì)算運(yùn)動(dòng)率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 解凍溫度的篩選

將精液與Hanks’稀釋的DMSO以1∶3的比例混合后, 置于程序降溫儀中, 以不同的降溫速率進(jìn)行冷凍處理, 然后保存于液氮中, 4個(gè)月后以35℃水浴解凍計(jì)算運(yùn)動(dòng)率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 解凍方法的篩選

將精液與 Hanks’液稀釋的不同種類的抗凍劑以1∶3的比例混合后, 置于程序降溫儀中, 平衡2 min,然后以20℃/min的速度降至–180℃并停留2 min, 最后快速轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行超低溫保存。保存 4個(gè)月后分別以 30、35、45、45、50℃水浴解凍, 計(jì)算運(yùn)動(dòng)率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 凍精活力持續(xù)時(shí)間

將精液與Hanks’稀釋的15%DMSO、15%EG、15%PG以 1∶3的比例混合后, 置于程序降溫儀中,以–30℃/min的降溫速率進(jìn)行冷凍處理, 然后保存于液氮中, 4個(gè)月后以35℃水浴解凍計(jì)算運(yùn)動(dòng)率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用平均值±SD表示, 用一元方差分析(ANOVA)進(jìn)行差異比較, 并運(yùn)用 SNK(Student-Newman-Keuls’test)分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn), 當(dāng)P＜0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 抗凍劑對(duì)凍精運(yùn)動(dòng)率的影響

抗凍劑對(duì)凍精運(yùn)動(dòng)率的影響如圖 1所示, 采用15% DMSO、15% EG、15% PG作為抗凍液保存的精子解凍后活力分別為(61.2±6.8)%、(56.6±9.1)%、(64.7±7.4)%, 雖然顯著低于對(duì)照(新鮮精子)的運(yùn)動(dòng)率,但它們之間的差異并不顯著。相對(duì)而言10% Meth保存的凍精的運(yùn)動(dòng)率較差, 顯著低于其他抗凍劑(P<0.05)。因此作者確定了15% DMSO、15% EG、15% PG都可作為美洲黑石斑精子冷凍保存的抗凍劑。

圖1 不同抗凍劑對(duì)凍精運(yùn)動(dòng)率的影響Fig. 1 Effect of different cryoprotectant on post-thaw sperm motility

2.2 降溫速率對(duì)凍精運(yùn)動(dòng)率的影響

降溫速率對(duì)凍精運(yùn)動(dòng)率的影響如圖 2所示, 將15% DMSO保存的凍精, 以10、15、20、25、30℃/min的降溫速率保存的凍精激活后其運(yùn)動(dòng)率并沒(méi)有顯著的差異(P＞0.05), 但相對(duì)于對(duì)照(新鮮精子)還是顯著降低(P＜0.05)。因此為了節(jié)省時(shí)間作者確定了30℃/min作為美洲黑石斑精子超低溫冷凍保存的降溫速率。

圖2 不同降溫速率對(duì)凍精運(yùn)動(dòng)率的影響Fig. 2 Effect of different cooling rate on post-thaw sperm motility

2.3 解凍溫度對(duì)精子運(yùn)動(dòng)率的影響

將15%DMSO保存的凍精, 分別以30、35、40、45、50℃的水浴解凍, 水浴溫度對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)率的影響見(jiàn)圖 3。結(jié)果顯示 30、35、40、45、50℃水浴解凍后的凍精的運(yùn)動(dòng)率間沒(méi)有顯著的差異(P> 0.05),但相對(duì)于對(duì)照(新鮮精子)還是顯著降低(P< 0.05)。鑒于實(shí)驗(yàn)操作的方便性, 因此作者確定 35℃作為美洲黑石斑凍精的解凍溫度。

圖3 不同解凍溫度對(duì)凍精運(yùn)動(dòng)率的影響Fig. 3 Effect of different thaw temperature on post-thaw sperm motility

2.4 凍精激活后活力持續(xù)時(shí)間

15%DMSO、15%EG、15%PG以30℃/min的降溫速率保存的凍精, 35℃水浴解凍后, 海水激活后活力狀況與激活時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)圖 4。凍精活力在 15 s之內(nèi)急速下降, 15 s時(shí)凍精的運(yùn)動(dòng)率只有剛剛激活時(shí)的1/3。冷凍精子活力持續(xù)的時(shí)間與鮮精比差異不顯著(P＞0.05), 但是活力下降速度明顯比鮮精快。

圖4 激活時(shí)間對(duì)凍精與凍精運(yùn)動(dòng)率的影響Fig. 4 The effect of activation time on post-thaw sperm motility

3 討論

適宜的抗凍劑是魚(yú)類精子保存成功的關(guān)鍵因素,不同的抗凍劑對(duì)不同種魚(yú)的精液保護(hù)作用差異很大。因此建立精子冷凍保存方法的首要因素是篩選最適宜的抗凍劑的種類及濃度。參考課題組之前對(duì)真鯛、大菱鲆、大黃魚(yú)等海水魚(yú)類冷凍保存的方法以及黑石斑魚(yú)精子的生理學(xué)特性, 作者確定了15%DMSO、EG%%、15%PG以及10%Meth作為主要的幾種抗凍劑進(jìn)行篩選。在美洲黑石斑精子超低溫保存中作者發(fā)現(xiàn)15% DMSO、15% EG、15% PG獲得了較好的保護(hù)效果。在DeGraaf[19]等報(bào)道0.5 mL的麥管冷凍的黑石斑魚(yú)精子采用10%DMSO也獲得了較好的保存效果。DMSO由于其具有較好的滲透性是魚(yú)類精子超低溫保存應(yīng)用最為廣泛的一種抗凍劑, 5%～20% DMSO在許多海水魚(yú)類精子的超低溫保存種都取得了令人滿意的效果, 例如, 金頭鯛(Sparus aurata)[20]、細(xì)須石首魚(yú)(sciaena russelli)[21]和大菱鲆[15,22]。在大黃魚(yú)精子超低溫保存中 10% DMSO也表現(xiàn)出較好的保護(hù)效果。EG、PG也是滲透性較好的抗凍劑在真鯛[8]精子超低溫保存中也獲得了較好的保存效果。但是對(duì)于大黃魚(yú)精子EG、PG作為保護(hù)劑冷凍的精子其運(yùn)動(dòng)率一般。然而PG、EG在細(xì)須石首魚(yú)[14,21], 金頭鯛[20]精子的超低溫保存取得了理想的運(yùn)動(dòng)率和受精率。在真鯛精子超低溫保存中DMSO、EG、PG也獲得了較好的保存效果[8-12,14]。但是 Meth 對(duì)美洲黑石斑的精子的保護(hù)效果較差,同樣在大黃魚(yú)[14]、真鯛[8]精子超低溫保存中也表現(xiàn)出較差的保存效果, 一些學(xué)者認(rèn)為這是由于Meth過(guò)強(qiáng)的毒性和滲透性造成的, 這也是實(shí)驗(yàn)中Meth選擇10%而不是15%的原因。因此抗凍劑種類以及濃度對(duì)精子的保護(hù)效果具有較強(qiáng)的魚(yú)的種的特異性, 因此適宜抗凍劑及其濃度的選擇是魚(yú)類精子成功保存的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

降溫速率和解凍溫度對(duì)魚(yú)類精子的超低溫保存有重要作用。冷凍、解凍過(guò)程都會(huì)造成精子遭受結(jié)晶或者重結(jié)晶的損傷。但是對(duì)于美洲黑石斑精子, 10～30 ℃/min的降溫速率、30～50℃水浴解凍溫度對(duì)冷凍解凍后的精子活動(dòng)率沒(méi)有明顯的影響。解凍溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致解凍時(shí)間較長(zhǎng), 而解凍溫度過(guò)高則影響操作的方便性, 因此在試驗(yàn)中作者選擇了 35℃水浴解凍。在大黃魚(yú)精液超低溫保存中作者發(fā)現(xiàn) 43℃水浴解凍其運(yùn)動(dòng)率明顯地高于 28℃水浴解凍[14], 然而在另一大黃魚(yú)精液冷凍保存實(shí)驗(yàn)林丹軍[23]等卻發(fā)現(xiàn)室溫解凍要優(yōu)于38～40℃水浴解凍。有文獻(xiàn)[24]報(bào)道解凍溫度的選擇應(yīng)取決于降溫速率, 以避免解凍過(guò)程中重結(jié)晶的形成。

作者首次采用程序降溫法成功地超低溫保存美洲黑石斑精液, 獲得了較為理想的保存效果, 并將冷凍的精子長(zhǎng)期保存于中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋動(dòng)物種質(zhì)庫(kù)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)作者建立了美洲黑石斑精液高效、系統(tǒng)、完整超低溫保存的方法, 此方法的建立對(duì)海水魚(yú)類種質(zhì)資源的保存和生物多樣性的保護(hù)具有重要意義。

[1] Gwo J C, Ohta H, Okuzawa K,et al. Cryopreservation of sperm from the endangered formosan landlocked salmon (Oncorhynchus masou formosanus)[J].Theriogenology, 1999, 51(3): 569-582.

[2] Van Der Walt L D, Van Der Bank F H, Steyn G J. The suitability of using cryopreservation of spermatozoa for the conservation of genetic diversity in African catfish (Clarias gariepinus)[J].Comparative Biochemistry and Physiology(Part A): Physiology, 1993, 106(2): 313-318.

[3] Tiersch T R, Wayman W R, Skapura D P,et al. Transport and cryopreservation of sperm of the common snook,Centropomus undecimalis(Bloch)[J].Aquaculture Research, 2004, 35(3): 278-288.

[4] Tiersch T R, Figiel C R, Wayman W R,et al, Cryopreservation of sperm of the Endangered Razorback Sucker[M]. Baton Rouge, Louisiana, USA:World Aquaculture Society, 2000: 95-104.

[5] Ohta H, Kawamura K, Unuma T, et al. Cryopreservation of the sperm of the Japanese bitterling[J].Journal of Fish Biology, 2001, 58(3): 670-681.

[6] Blaxter J H S. Sperm storage and cross-fertilization of spring and autumn spawning herring[J].Nature, 1953, 172: 1189-1190.

[7] Gwo J C. Cryopreservation of sperm of some marine fishes[M]. Baton Rouge, Louisiana, USA: World Aquaculture Society, 2000, 138-160.

[8] Liu Q, Li J, Zhang S,et al. An efficient methodology for cryopreservation of spermatozoa of red seabream,Pagrus major, with 2-mL cryovials[J].Journal of the World Aquaculture Society, 2006, 37(3): 289-297.

[9] Liu Q H, Li J, Xiao Z Z,et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) to evaluate the quality of cryopreserved sperm in red seabream (Pagrus major)[J].Aquaculture, 2007, 263(1-4): 20-25.

[10] Liu Q H, Li J, Zhang S C,et al. Flow cytometry and ultrastructure of cryopreserved red seabream (Pagrus major) sperm[J].Theriogenology, 2007, 67(6): 1168-1174.

[11] Liu Q H, Chen Y K, Xiao Z Z,et al. Effect of storage time and cryoprotectant concentrations on the fertilization rate and hatching rate of cryopreserved sperm in red seabream (Pagrus majorTemminck & Schlegel, 1843)[J].Aquaculture Research, 2010, 41(9): 89-95.

[12] 李純, 李軍, 薛欽昭. 真鯛精子的超低溫保存研究[J].海洋科學(xué), 2001, 25(12): 1-4.

[13] 葉霆, 竺俊全, 楊萬(wàn)喜,等. 黑鯛精子的超低溫凍存及 DNA 損傷的 SCGE 檢測(cè)[J].動(dòng)物學(xué)研究, 2009, 30(2): 151-157.

[14] 肖志忠, 陳雄芳, 丁福紅, 等. 大黃魚(yú)精液的高效超低溫保存[J].海洋科學(xué), 2007, 31(4): 1-4.

[15] Chen S L, Ji X S, Yu G C,et al. Cryopreservation of sperm from turbot (Scophthalmus maximus) and application to large-scale fertilization[J].Aquaculture, 2004, 236(1-4): 547-556.

[16] Chen S L,Tian Y S. Cryopreservation of flounder (Paralichthys olivaceus) embryos by vitrification[J].Theriogenology, 2005, 63(4): 1207-1219.

[17] 洪萬(wàn)樹(shù), 張其永, 許勝發(fā),等. 花鱸精子生理特性及其精液超低溫冷凍保存[J].海洋學(xué)報(bào), 1996, 18: 97-104.

[18] 雷霽霖, 盧繼武. 美洲黑石斑魚(yú)的品種優(yōu)勢(shì)和養(yǎng)殖前景[J].海洋水產(chǎn)研究, 2007, 28(5): 110-115.

[19] DeGraaf J D, King W, Benton C,et al. Production and storage of sperm from the black sea bassCentropristis striataL[J].Aquaculture Research, 2004, 35(15): 1457-1465.

[20] Fabbrocini A, Lavadera S L, Rispoli S,et al. Cryopreservation of seabream (Sparus aurate) spermatozoa[J].Cryobiology, 2000, 40: 46-53.

[21] Gwo J C, Strawn K, Longnecker M T,et al. Cryopreservation of Atlantic croaker spermatozoa[J].Aquaculture, 1991, 94(4): 355-375.

[22] Dreanno C, Suquet M, Quemener L, et al. Cryopreservation of turbot (Scophthalmus Maximus) spermatozoa[J].Theriogenology, 1997, 48: 589-603.

[23] 林丹軍, 尤永隆. 大黃魚(yú)精子生理特性及其冷凍保存[J].熱帶海洋學(xué)報(bào), 2002, 21(4): 69-75.

[24] Gwo J C. Cryopreservation of black grouper (Epinephelus malabaricus) spermatozoa[J].Theriogenology, 1993, 39: 1331-1324.

(本文編輯: 譚雪靜)

An efficient methodology of sperm cryopreservation inCentropristis striata

LIU Hong-jun1, GUAN Shu-guang1, LIU Qing-hua2, LI Jun2, YU Dao-de1
(1. Mariculture Institute of Shandong Province, Qingdao 266002, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Sept.,21, 2011

Centropristis striata; cryopreservation; cryoprotectant; sperm motility

In the present study,Centropristis striatasperm was efficiently cryopreserved using a programmable freezer. The motility of both fresh and post-thaw sperm was investigated in order to optimize the sperm cryopreservation protocols forC. striata. Four cryoprotectants (15% dimethyl sulfoxide, 15% ethylene glycol, 15% propylene glycol and 10% methanol), five cooling rates (10, 15, 20, 25 and 30℃/min) as well as five thawing temperatures (30, 35, 40, 45 and 50 ℃) were designed and tested in the sperm cryopreservation, and their effects on post-thaw sperm motility were studied. Optimal post-thaw motility (>60%) were achieved when using Hanks’s supplemented with 15% DMSO, 15% PG and 15% EG with 30℃/min cooling rate, and 35℃ water bath. An efficient cryopreservation method forC. striatasperm was established by analyzing the effect of cryoprotectants, cooling rates and thaw temperatures. This method is advantageous not only to establish laboratory experiment but also to preserve genetic resources for routine aquaculture hatchery operation.

Q331

A

1000-3096(2013)01-0076-05

2011-09-21;

2011-12-06

農(nóng)業(yè)部 948項(xiàng)目(2011-Z39); 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所知識(shí)創(chuàng)新工程領(lǐng)域前沿項(xiàng)目(Y02507101Q); 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41076100, 31072212)

劉洪軍(1964-), 男, 山東博興人, 研究員, 主要從事海洋生物學(xué)研究, 電話: 0532-82655169, E-mail: hongjunl@126.com;于道德,通信作者, E-mail: wensentte@163.com