SRAP和ITS分子標(biāo)記在大興安嶺地區(qū)野生黑木耳遺傳多樣性上的應(yīng)用

張 旭，李 倩，劉華晶，劉科然，張鈺雪，劉騰飛，楊永迪

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030)

黑木耳學(xué)名Auricularia auricula(L.ex Hook)Underw，亦稱(chēng)木耳、光木耳、云耳等，隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)，異擔(dān)子菌綱(Heterobasidiomycetes)，木耳目(Auriculariales)，木耳科 (Auriculariaceae)，木耳屬 (Auricularia)［1］。黑木耳經(jīng)長(zhǎng)期的人工馴化和自然選擇，其遺傳背景非常復(fù)雜，因此掌握其遺傳關(guān)系是黑木耳育種工作的關(guān)鍵。

隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，基于PCR的標(biāo)記體系類(lèi)型多樣，應(yīng)用廣泛，但各自的復(fù)雜性、可靠性與遺傳信息不同［2］，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為分析黑木耳遺傳多樣性的主要手段之一［3］。目前分子標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SRAP等。在眾多的分子標(biāo)記中，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence－Related Amplified Polymorphism，SRAP)是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros博士于2001年在蕓苔屬植物上開(kāi)發(fā)出的新型分子標(biāo)記技術(shù)［4］。SRAP利用特定引物對(duì)ORFs區(qū)域(Open Reading Frames)進(jìn)行擴(kuò)增，具有簡(jiǎn)單、高效、高共顯性、重復(fù)性、易測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，目前該技術(shù)已被用于馬鈴薯、甜瓜、油菜、大棗等作物［5］中，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。ITS(Internal transcribed spacer)是核糖體rDNA中介于18s與5.8s之間的ITS1、及5.8S與28S之間的ITS2的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，進(jìn)化速率較快且片段長(zhǎng)度適中(高等真菌一般小于1 000bp)，加上協(xié)調(diào)進(jìn)化，使得該片段在基因組不同重復(fù)單元間十分一致，成為高等真菌屬內(nèi)種間及種群系統(tǒng)學(xué)研究的核基因標(biāo)記［6］。真菌的rDNA的ITS區(qū)段的保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致、種間差異比較明顯，這一特點(diǎn)使得ITS區(qū)段不僅適合于屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定［7］。

目前對(duì)黑木耳野生菌株的種質(zhì)資源研究尚處于空白階段，野生資源多樣性是否豐富決定能否選育出優(yōu)質(zhì)黑木耳菌株。開(kāi)展黑木耳野生種質(zhì)遺傳多樣性研究，對(duì)于黑木耳有益種質(zhì)資源的收集、保存、評(píng)價(jià)和利用具有重要意義。本研究對(duì)黑龍江省境內(nèi)大興安嶺地區(qū)采集的14株野生黑木耳菌株和該地區(qū)6個(gè)栽培面積較大的黑木耳菌株進(jìn)行初步鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)黑木耳的rDNA ITS區(qū)段進(jìn)行序列測(cè)定和序列特征比較分析，并進(jìn)一步對(duì)ITS序列進(jìn)行核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank同源性檢索比對(duì)，構(gòu)建起系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以期為基于傳統(tǒng)形態(tài)特征對(duì)20個(gè)黑木耳菌株的分類(lèi)鑒定提供分子依據(jù)，為黑木耳優(yōu)良菌種選育及建立種質(zhì)資源信息庫(kù)提供依據(jù)。對(duì)野生黑木耳進(jìn)行種質(zhì)資源的分析與鑒定在國(guó)內(nèi)外尚屬首次。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共20株，其中14個(gè)野生黑木耳樣品于2009—2010年采自大興安嶺地區(qū)(7～20號(hào))，采樣后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離工作，6株栽培菌株選自大興安嶺地區(qū)栽培品種(1～6號(hào))，具體情況見(jiàn)表1。

表1 供試材料及來(lái)源Tab.1 The tested strains and their locations

1.2 供試菌株的分離純化及培養(yǎng)

采用組織分離法對(duì)菌株進(jìn)行組織分離培養(yǎng)，將活化后的菌種接入250mL三角瓶液體PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，120rpm于搖床上培養(yǎng)7d得到菌絲備用。

1.3 菌株總DNA的提取

對(duì)菌絲體基因組總DNA采用改進(jìn)的CTAB法提取。在含有0.5μg/mL溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)DNA樣品的質(zhì)量和濃度，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.4 反應(yīng)體系及程序

1.4.1 SRAP 反應(yīng)體系及程序

根據(jù)Li和Quiros(2001)設(shè)計(jì)SRAP引物序列，設(shè)計(jì)6個(gè)上游引物和8個(gè)下游引物，由上海生物工程技術(shù)公司合成。從6個(gè)上游引物和8個(gè)下游引物組合的48對(duì)引物中挑選擴(kuò)增效果較好、多態(tài)性高、穩(wěn)定性較強(qiáng)的引物對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系為 25μL，含 1×PCR buffer，2 mmol/L MgC12，dNTPs 0.2mmol/L(TaKaRa)，Tag 酶 0.75U(TaKa-Ra)，模板DNA30 ng，正向和反向引物各30 ng，不足部分ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增重復(fù)3次。

擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃復(fù)性1 min，5 個(gè)循環(huán);94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃復(fù)性1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃結(jié)束保存。取 PCR產(chǎn)物3μL與3μL 6×Loding Buffer混勻，以1×TAE為電泳緩沖液，在含有0.5μg/mL溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠上電泳40min，恒壓100V，采用DL2000為marker，凝膠成像系統(tǒng)照像。

1.4.2 ITS 反應(yīng)體系及程序

選用通用引物ITS1和ITS4(ITS1:5’－TCCGTAGGTGAACCTGC－3’;ITS4:5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC －3’)擴(kuò)增5.8S rDNA及其兩側(cè)的ITS1和ITS2基因片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Bio－Rad iCycler thermal cycler上進(jìn)行。反應(yīng)體積為50μL，其成分為:模板:1μL，引物ITS 1和ITS 4(2×10－5mol/L)各 5μL(上海生工)，10×PCR 緩沖液(pH8.3)5μL，dNTP(0.01mol/L)4μL(TaKaRa)，Taq 酶(5U/μL)0.25μL(TaKaRa)，無(wú)菌雙蒸水定容至50μL。

ITS－PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃1 min，54℃退火1 min，72℃延伸 1.5 min，循環(huán) 36 次，72℃延伸10min，產(chǎn)物于4℃保存。PCR擴(kuò)增重復(fù)3次。

1.4.3 ITS 序列測(cè)定

采用PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，將PCR純化產(chǎn)物與pMD18－T Vector(TaKaRa)連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，用含 X－Gal、IPTG、Amp的 LB平板進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取白色菌落培養(yǎng)，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。克隆成功后，樣品委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序在ABI Prism 3730XL儀器上進(jìn)行，測(cè)序試劑為BigDye Terminator v3.1，采用單向測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.5.1 SRAP 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

電泳圖譜中每一條擴(kuò)增帶均代表了引物與模板DNA互補(bǔ)的一對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，可記為一個(gè)分子標(biāo)記，有帶的記為1，無(wú)帶的記為0，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)稱(chēng)0/1矩陣。利用NTSYS－pc(Version 2.10)軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析并構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)圖。

1.5.2 ITS 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

根據(jù)Keller et al的方法查找ITS序列，序列的比對(duì)采用軟件 ClustalX 2.0。利用 BioEdit version 7.0.5 軟件進(jìn)行人工調(diào)整。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA 4.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以最大簡(jiǎn)約法(Maximum Parsimony，MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及擴(kuò)增情況

從48對(duì)SRAP引物中篩選出9對(duì)引物，共擴(kuò)增出88條，其中具有多態(tài)性條帶76條，占總帶數(shù)的84.6%，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出條帶9.7條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶8.4條，平均多態(tài)性比例為76.8%。SRAP所檢測(cè)的9對(duì)標(biāo)記在20個(gè)菌株中均具有明顯的多態(tài)性，但每個(gè)標(biāo)記所顯示的多態(tài)信息含量不同。SRAP各標(biāo)記的PIC變幅在0.048～0.918，以 ME3+EM2 引物組合的最高(0.918)，ME4+EM8引物組合最低(0.048)。絕大多數(shù)標(biāo)記的PIC值大于0.5，而衡量多態(tài)信息量高低的指標(biāo)一般認(rèn)為PIC＞0.5 時(shí)，為高度多態(tài)位點(diǎn)［8］。平均 PIC 分別為 0.682，表明本研究所用菌株基因型豐富，遺傳多樣性較高，同時(shí)說(shuō)明SRAP標(biāo)記對(duì)黑木耳菌株具有較強(qiáng)的鑒別能力。

2.2 遺傳相似性分析

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶型計(jì)算出SRAP標(biāo)記20個(gè)菌株間遺傳距離為0.122～0.507，ITS序列分析表明20個(gè)菌株間遺傳距離為0.100～0.650，進(jìn)一步說(shuō)明了供試黑木耳菌株具有豐富的遺傳多樣性。對(duì)栽培菌株和野生菌株的遺傳距離參數(shù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，栽培菌株的遺傳距離及其變化范圍和變異系數(shù)均小于野生菌株，二者的平均遺傳距離差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，說(shuō)明野生菌株的遺傳基礎(chǔ)較寬，兩種分子標(biāo)記均顯示野生菌株之間的遺傳距離(SRAP和ITS分別為0.405、0.368)大于栽培菌株間的遺傳距離(SRAP和ITS遺傳距離分別為0.339、0.320)，表明野生菌株遺傳多樣性優(yōu)于栽培菌株。如表2所示。

表2 栽培品種與野生品種的遺傳距離參數(shù)Tab.2 Parameters of genetic distance between cultural and wild strains

2.3 構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)

根據(jù)SRAP標(biāo)記遺傳距離，采用NTSYS軟件對(duì)圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖1)，ITS序列用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。在圖1中可以看出，在系數(shù)為0.61水平上，SRAP將20個(gè)菌株可以分為2類(lèi)，不同類(lèi)菌株間有親緣關(guān)系相對(duì)比較近的趨勢(shì)，如在系數(shù)為0.65的水平上1、2、4、5號(hào)栽培菌株相對(duì)親緣關(guān)系較近。個(gè)別野生菌株間親緣關(guān)系較近，如16號(hào)與17號(hào)之間遺傳相似系數(shù)為0.878。在圖2中可以看出，20個(gè)黑木耳菌株聚為2大類(lèi)，3、4、5、6號(hào)與8個(gè)野生菌株聚為一類(lèi)，1、2號(hào)與6個(gè)野生菌株聚為一類(lèi)，同樣沒(méi)有表現(xiàn)出野生菌株與栽培菌株各自聚類(lèi)的趨勢(shì)。黑木耳菌株栽培品種與野生菌株之間、野生菌株與野生菌株之間遺傳多樣性豐富，如3號(hào)(延明1號(hào))與9號(hào)(LY)之間的遺傳距離為0.65，同為加格達(dá)奇地區(qū)采集菌株11號(hào)(64)與14號(hào)(JGDQ)之間遺傳距離為0.63，其余菌株相互間遺傳距離均在0.01～0.65。兩種方法所建聚類(lèi)圖大體相似，均體現(xiàn)出菌株間遺傳多樣性比較豐富，因此可為黑木耳由野生菌株選育成為栽培菌株提供較好的育種材料，同時(shí)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近可以為菌株間原生質(zhì)體育種提供理論依據(jù)。

圖1 SRAP標(biāo)記遺傳關(guān)系的聚類(lèi)圖Fig.1 Dendrogram of 20 Auricularia auricula strains generated by SRAP marker based on genetic distance

圖2 用MEGA4.1軟件分析的黑木耳系統(tǒng)樹(shù)Fig.2 MP tree of Auricularia auricula analysised by MEGA4.1

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)野生黑木耳的種植資源研究處于空白狀態(tài)。黑木耳的研究熱點(diǎn)集中在國(guó)內(nèi)人工栽培面積較大的幾十個(gè)菌種。本研究中所用的48對(duì)SRAP引物在20個(gè)菌株中所顯示的多態(tài)性不一致，18對(duì)引物多態(tài)性較低，21對(duì)引物多態(tài)性不穩(wěn)定，9對(duì)引物能顯示出較高且穩(wěn)定的多態(tài)性，平均PIC值0.682，較高的多態(tài)信息含量說(shuō)明SRAP標(biāo)記具有較高的鑒別能力，可作為一種很好的品種鑒定手段。13個(gè)野生菌株遺傳距離在0.0562～0.6937，高于李輝平研究中21個(gè)黑木耳菌株遺傳距離在0.36～0.55的結(jié)果［9］，說(shuō)明野生菌株遺傳多樣性高于栽培菌株，可能是在人工育種過(guò)程中導(dǎo)致野生菌株部分遺傳信息消失造成的。通過(guò)對(duì)14個(gè)野生黑木耳菌株的序列分析表明，大興安嶺地區(qū)野生黑木耳菌株遺傳多樣性豐富，ITS區(qū)序列信息位點(diǎn)豐富，不同的野生黑木耳類(lèi)群均有多個(gè)特異性的單核苷酸變異位點(diǎn)，當(dāng)根據(jù)黑木耳的形態(tài)和性狀難以鑒別區(qū)分時(shí)，采用ITS序列對(duì)黑木耳屬資源評(píng)價(jià)和遺傳育種研究具有一定指導(dǎo)意義。從結(jié)果看，ITS和SRAP都能很好地對(duì)黑木耳進(jìn)行聚類(lèi)分析，而且產(chǎn)生的結(jié)果相似，說(shuō)明兩者相結(jié)合能更好地用于黑木耳的遺傳多樣性分析。

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