頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定山楂核煙熏液的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

姜紹通，王 旗，蔡克周，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009)

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定山楂核煙熏液的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

姜紹通，王 旗，蔡克周，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009)

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)測定山楂核煙熏液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。通過比較不同萃取頭、萃取溫度以及萃取時間對萃取效果的影響，獲得較適的萃取條件為：50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取溫度40℃、萃取時間50min。采用GC-MS對解吸物進行測定的結(jié)果表明，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要成分中酚類

頂空固相微萃?。粴赓|(zhì)聯(lián)用；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；山楂核煙熏液

煙熏食品由于其獨特的風(fēng)味深受人們喜愛[1]。傳統(tǒng)方法通過控制燃燒木材產(chǎn)生的煙霧和高溫對食品進行熏制，這種方法雖然可以賦予食品良好的色澤和煙熏香味，但是煙霧中大量的多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)會給食品帶來污染[2]。國外在20世紀80年代嘗試以天然植物(如棗核、山楂核等)為原料，經(jīng)高溫干餾、提純精制得到液體煙熏香味料[3]，經(jīng)過精制分離的液體煙熏香味料，不僅保留對香味起作用的重要組分，更可以極大地降低有毒化合物的含量[4]，是一種食用安全的食品添加劑。我國科學(xué)家在20世紀90年代開始以山楂核為原料，經(jīng)過控制性發(fā)煙燃燒、煙氣冷凝、分餾、精制等工藝，制備出山楂核煙熏香味料[5]，并且制定了煙熏香味料行業(yè)標準，對主要成分進行規(guī)范限定[6]。但是至今混合物主要成分仍然沒有見報道，特別是其揮發(fā)性香氣成分仍然不清楚。

固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)技術(shù)是20世紀90年代興起的一項新穎的樣品前處理與富集技術(shù)[7]。頂空固相微萃取(HS-SPME)是將SPME萃取頭置于樣品頂空中的萃取法[8]，它廣泛應(yīng)用于揮發(fā)、半揮發(fā)性成分的檢測，具有靈敏度高、重復(fù)性及線性好、操作簡單方便快速等特點，并能較真實的反映樣品的風(fēng)味組成[9]。

本實驗對山楂核煙熏香味料的理化性質(zhì)和揮發(fā)性香氣成分進行全面的檢測分析，為液體煙熏香味料的應(yīng)用與質(zhì)量控制提供分析評價實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂核煙熏香味料 濟南華魯食品有限公司。

無水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、氫氧化鉀、酚酞、硼酸、氯化鉀、溴酚藍、鹽酸羥胺、硝酸、高氯酸、鹽酸、鐵氰化鉀、硼氫化鈉、硫脲、硫酸、無水硫酸鈉、2,6-二氯醌氯亞胺、愈創(chuàng)木酚(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；苯并芘標準品(分析純) 百靈威有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；SPME手動進樣手柄及萃取頭(100μm PDMS； 65μm PDMS/DVB；75μm CAR/PDMS；50/30μm DVB/CAR/ PDMS) 美國Supelco公司；721型分光光度計 上海光譜儀器有限公司；分析天平 上海?？惦娮觾x器；PH-107袖珍數(shù)顯筆式酸度計 廣州銘睿電子科技有限公司。1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：DB-5ms石英毛細柱(30m×0.25mm，1μm)；升溫程序：起始溫度40℃，保持2min，然后以8℃/min的升溫速率升溫到70℃，再以5℃/min的升溫速率升溫到200℃，最后以15℃/min的升溫速率升溫到250℃，保持2min；汽化室溫度：250℃；載氣(He)流速2.0mL/min；分流比：1:1。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電子電離(electron ionization，EI)離子源，電子能量70eV，燈絲發(fā)射電流200μA，離子源溫度240℃，接口溫度250℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～450。

1.3.3 萃取頭的老化處理

萃取頭在第1次使用時，需要按照廠家說明在氣相色譜進樣口于250℃老化2h以上至無雜峰，以后使用前需于250℃處理30min，以確保脫去其可能吸附的揮發(fā)性成分[10]。取2mL山楂核煙熏液置于15mL的樣品瓶中，將SPME針管插入樣品瓶，調(diào)整并固定萃取頭在樣品瓶中的位置，伸出纖維頭。待吸附完畢，縮回纖維頭，抽出針頭，將萃取頭插入GC-MS聯(lián)用儀，于250℃解吸2min，進行GC-MS檢測分析。

1.3.4 萃取工藝條件優(yōu)化實驗

固相微萃取過程中影響萃取效果的主要因素包括萃取頭的種類、萃取溫度及萃取時間[11]。萃取工藝條件優(yōu)化實驗以總峰面積和檢出峰的個數(shù)為指標[12]，通過單因素試驗考察各因素對頂空固相微萃取效果的影響，并確定較優(yōu)的萃取工藝。對于萃取頭的優(yōu)化，本實驗采用的4種萃取頭分別為：100μm PDMS、65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS、50/30μm DVB/CAR/PDMS，在吸附溫度40℃，吸附時間40min，解吸時間2min條件下進行萃取實驗；對于萃取溫度的優(yōu)化，采用50/30μm DVB/CAR/ PDMS萃取頭，在吸附溫度分別30、40、50、60℃，吸附時間40min，解吸時間2min條件下進行萃取實驗；對于萃取時間的優(yōu)化，采用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，吸附溫度40℃，吸附時間30、40、50、60min，解吸時間2min條件下進行萃取實驗。

1.3.5 基本理化性質(zhì)的測定

色狀的檢定方法：將試樣置于一潔凈白紙上，用目測法進行觀察；香氣的評定：參考GB/T 14454.2—2008《香料：香氣評定法》進行評定；相對密度的測定：參考GB/T 11540—2008《香料：相對密度的測定》進行測定；酸含量的測定：參考GB/T 14457.4—1993《單離及合成香料：酸值或含酸量的測定》進行測定；酚含量的測定：采用修正吉布斯法進行測定；羰基化合物含量的測定：參考GB/T 14454.13—2008《香料：羰值和羰基化合物含量的測定》進行測定；重金屬含量的測定：參考GB 5009.12—2010《食品中鉛的測定》進行測定；砷含量的測定：參考GB/T 5009.11—2003《食品中總砷及無機砷的測定》進行測定；苯并(a)芘含量的測定：參考GB/T 5009.27—2003《食品中苯并(a)芘的測定》進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 定性分析

通過GC-MS分析軟件，化合物經(jīng)計算機檢索與計算機標準譜圖庫NIST 05及NIST 05S中的數(shù)據(jù)比較(最大值1000)，相似指數(shù)(similarity index，SI)800以上即為確認化合物。

1.4.2 定量分析

按峰面積歸一法計算化合物相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂核煙熏香味料的基本理化性質(zhì)

表1 山楂核煙熏液的基本理化性質(zhì)Table1 Pphysical and chemical properties of liquid smoke flavoring

由表1可知，山楂核煙熏液是具有濃郁煙熏風(fēng)味的淡黃色液體，其中酸、酚及羰基化合物的含量較高，分別達到12.414%、5.707mg/mL及3.834g/100mL。同時檢測出煙熏液中苯并(a)芘含量為0.7μg/kg，而重金屬和砷的含量未檢出，完全符合GB 2762—2005《食品中污染物限量》對于食品中苯并芘、重金屬及砷的限量指標。

2.2 萃取條件優(yōu)化

2.2.1 萃取頭的選擇

圖1 不同萃取頭的萃取效果Fig.1 Effects of different fibers on extraction efficiency

萃取頭是整個固相微萃取裝置的核心，萃取頭涂層材料不同對物質(zhì)的萃取吸附能力有影響[13]。一般選擇SPME萃取頭應(yīng)根據(jù)所分析物的分子質(zhì)量和極性。

由圖1看出，對山楂核煙熏液揮發(fā)性成分的總吸附量來說，50/30μm DVB/CAR/PDMS(總峰面積為3.69×107)顯示出良好的吸附能力，吸附量最大，其次為65μm PDMS/DVB(總峰面積1.36×107)，75μm CAR/PDMS(總峰面積1.29×107)和100μm PDMS(總峰面積0.93×107)，說明50/30μm DVB/CAR/PDMS的吸附能力比其他的萃取頭強。吸附揮發(fā)性成分數(shù)目最多的是50/30μm DVB/ CAR/PDMS(總峰個數(shù)100)，其次為65μm PDMS/DVB(總峰個數(shù)75)，100μm PDMS (總峰個數(shù)63)和75μm CAR/ PDMS(總峰個數(shù)55)。因此，對山楂核煙熏液而言，50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭更為合適，不僅吸附能力強，而且分離解吸出的成分比較多。Howard等[14]認為采用DVB/CAR/PDMS萃取頭對于易揮發(fā)性組分和極性化合物的分析更為有效，與本實驗研究結(jié)果一致。因而選擇50/30μm DVB/CAR/PDMS作為實驗用萃取頭。

2.2.2 萃取溫度的選擇

萃取溫度對SPME法吸附樣品的影響具有兩面性，一方面，溫度升高會加快樣品分子熱運動，導(dǎo)致液體樣品蒸汽壓的增大，有利于分析物在基質(zhì)中的擴散，從而縮短平衡時間，尤其對于頂空固相微萃??；另一方面，萃取頭涂層的吸附是一個放熱過程，過高的溫度會使分配系數(shù)下降，直接導(dǎo)致吸附量下降和檢測靈敏度的降低[15]。

圖2 不同萃取溫度的萃取效果Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由圖2看出，隨著萃取溫度的升高，總峰面積和總峰個數(shù)均在40℃時達到最大值，高于40℃后總峰個數(shù)減少，在60℃時總峰面積雖有所增加，但硅氧烷類雜質(zhì)峰的個數(shù)明顯增加，這可能是由于溫度過高萃取頭的吸附速率低于解吸速率。因此，選用40℃作為萃取溫度。

2.2.3 萃取時間的選擇

萃取時間是指待測物在各相達到或接近平衡的時間，影響萃取時間的因素主要有萃取頭涂層的厚度及理化性質(zhì)、分配系數(shù)、樣品的擴散系數(shù)、頂空體積、萃取溫度等[16]。萃取開始時萃取頭涂層中物質(zhì)濃度增加得很快，吸附速度快，接近平衡時速度會減慢，因此萃取過程中不必達到完全平衡，在接近平衡時即可完成萃取過程。

圖3 不同萃取時間的萃取效果Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

由圖3看出，隨著萃取時間的延長，總峰面積呈不斷上升的趨勢。在30～50min時，隨著萃取時間的延長，總峰個數(shù)增加，但是由于存在吸附-解吸平衡問題，60min時檢出的總峰個數(shù)卻減少了。因此，綜合考慮選擇50min為萃取時間，此時檢出的化合物種類最多，吸附的樣品量也足夠用于氣質(zhì)聯(lián)用分析。

2.2.4 山楂核煙熏液揮發(fā)性成分的分析鑒定

山楂核煙熏液樣品用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在40℃條件下萃取50min后用GC-MS檢測，通過譜庫檢索鑒定出79種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，其中酚類20種、酮類16種、酯類9種、呋喃類6種、酸類6種、醛類3種、醚類3種，其他為含氮或苯環(huán)、雜環(huán)化合物，揮發(fā)性風(fēng)味化合物的相對含量見表2。

表2 山楂核煙熏液樣品的GC-MS分析結(jié)果((n==33))Table2 Volatile compounds identified by GC-MS in liquid smoke flavoring (n==33))

續(xù)表2

從表2可以看出，山楂核煙熏液的揮發(fā)性成分中有55.526%酚類物質(zhì)、18.710%酯類物質(zhì)、16.162%醛類物質(zhì)、3.252%酮類物質(zhì)、2.108%呋喃類物質(zhì)、1.019%酸類物質(zhì)和其他含氮、苯環(huán)或雜環(huán)化合物。酚類物質(zhì)是煙熏香味的主要來源[17]，也是抗氧化的最有效成分[18]，具有一定的防腐除臭作用，可用于食品的抗菌防腐和抗氧化酸敗。但單純的酚的煙熏味較為單調(diào)，糠醛、乙酰呋喃等能提供甜香和花香氣味，使強烈的酚的煙熏氣味變得較為緩和，令人愉快能接受[12]。酚類與醛的氧化聚合反應(yīng)及同肉蛋白的褐變反應(yīng)可形成加工肉食中煙熏色澤[19]。由于醛類閾值較低，對山楂核煙熏液的整體香味貢獻很大[20]，例如具有苦杏仁氣味的糠醛是美拉德反應(yīng)的特征產(chǎn)物[21]。有機酸具有抗菌、調(diào)味等功效，在加工肉食中與羧酸反應(yīng)促使肉蛋白和脂肪凝結(jié)，使肉的表面形成一層薄膜，有助于煙熏色澤的保持[22]。山楂核煙熏液中的各種有機成分相互協(xié)同作用，使煙熏液的煙熏香氣保持濃郁純正、引人食欲[23]，在實際應(yīng)用中發(fā)揮出人工合成所無法替代的效果。

3 結(jié) 論

3.1 通過國家標準方法檢測山楂核煙熏液，其中酸含量為12.414%，酚含量為5.707mg/mL，羰基化合物含量為3.834g/100mL，苯并(a)芘含量為0.7μg/kg，未檢出重金屬及砷含量。

3.2 對4種不同萃取頭的比較結(jié)果表明，50/30μm DVB/ CAR/PDMS萃取頭對山楂核煙熏液的風(fēng)味物質(zhì)有較好地吸附能力；綜合考察萃取條件確立的較優(yōu)組合參數(shù)為：50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取溫度40℃、萃取時間50min。

3.3 山楂核煙熏液中揮發(fā)性成分主要是酚類化合物占55.526%、酯類化合物占18.710%、醛類化合物占16.162%、酮類化合物占3.252%、呋喃類化合物占2.108%、酸類化合物占1.019%。

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Analysis of Volatile Flavors in Liquid Smoke Flavoring by Head-Space Solid Phase Microextraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

JIANG Shao-tong，WANG Qi，CAI Ke-zhou，PAN Li-jun
(Key Laboratory for Agriculture Products Proceeding of Anhui Province, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Liquid smoke flavoring, also known as wood vinegar, has been applied to a variety of low temperature meat products. In order to ascertain the flavor characteristics of liquid smoke flavoring, its volatile compounds were evaluated by head-space solid phase micro-extraction (HS-SPME) and capillary gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Extractions conditions such as different SPME fibers, extraction time and extraction temperature were optimized in this study. The optimal extraction conditions were obtained as follows: 50/30 μm DVB/ CAR/PDMS fiber and adsorption for 50 min at 40 ℃. Phenols, esters, aldehydes, ketones, furans and acids were the major flavor compounds of liquid smoke flavoring with relative contents of 55.526%, 18.710%, 16.162%, 3.252%, 2.108% and 1.019%, respectively.

head space solid phase micro-extraction (HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；volatile flavor compound；liquid smoke flavoring

TS207.3

A

1002-6630(2013)18-0206-06

10.7506/spkx1002-6630-201318042

2012-09-02

安徽省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)項目(11010301017)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(2012HGBZ0184)；淮北市重大科技攻關(guān)項目(20120103)；合肥工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目(2011CXCY379)

姜紹通(1954—)，男，教授，本科，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品生物化工。E-mail：jiangshaotong@yahoo.com.cn

占55.526%、酯類占18.710%、醛類占16.162%、酮類占3.252%、呋喃類占2.108%、酸類占1.019%。