甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲多功能氧化酶和羧基酰胺酶活性的影響1)

鐘 華 曹傳旺 薛 煜 嚴善春

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

舞毒蛾(Lymantria dispar)屬鱗翅目(Lepidoptera)毒蛾科(Lymantridae)，是一種食性廣譜的食葉害蟲，能取食500 多種植物，主要為害楊、柳、櫟、榆、桑、樺、油杉、沙棘、落葉松、蘋果、梨、杏、桃、柑桔、山楂等樹木［1－3］，給農林業(yè)經濟造成嚴重的損失。甲氧蟲酰肼屬于酰肼類擬蛻皮激素類殺蟲劑，能模擬20 －羥基蛻皮激素與目標害蟲蛻皮激素受體復合物相互作用，以蛻皮激素的作用方式導致昆蟲致死性蛻皮［4］。該藥劑對鱗翅目昆蟲具有高度的選擇毒性，對非靶標生物以及環(huán)境安全，已經成為防治蔬菜、棉花、玉米及其他農作物上多種鱗翅目害蟲的理想藥劑［5］。害蟲對殺蟲劑的氧化代謝，在其抗藥性形成中起重要作用。其中，多功能氧化酶(MFOs)能夠催化各種結構不同的內源或外源化合物氧化，如:脂肪酸、甾體激素、藥物、殺蟲劑及各種環(huán)境有害化合物等［6］。王建軍［7］等研究發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量甲氧蟲酰肼對斜紋夜蛾MFOs 具有一定的誘導作用。廖月枝等［8－9］研究表明甲氧蟲酰肼能有效干擾舞毒蛾幼蟲體內羧酸酯酶、MFOs、谷胱甘肽S －轉移酶活性及不同組織中蛋白質的表達。甲氧蟲酰肼分子結構中含有芳基酰胺結構，而廣泛存在于昆蟲體內的酰胺酶則被認為可能參與帶有這類結構的某些農藥的水解作用，在昆蟲對具有此類結構的殺蟲劑抗性中可能起著重要作用［10］。劉玉娣等［11］報道指出小菜蛾對抑太保的敏感性差異較大，并且其體內羧基酰胺酶的活力會隨著溫度及蟲齡的變化而改變。但迄今為止，國內外有關甲氧蟲酰肼對羧基酰胺酶活性的影響研究報道較少。筆者研究甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲MFOs 及其酰胺酶活性的影響，為明確甲氧蟲酰肼對舞毒蛾的毒理分子機制及開發(fā)新型蛻皮激素類似物提供理論依據(jù)，以便在林間合理防治舞毒蛾的危害。

1 材料與方法

供試昆蟲:2010年3月在東北林業(yè)大學校園及其示范林場內采集舞毒蛾卵塊，將卵塊置于人工智能培養(yǎng)箱內孵化，用人工飼料飼養(yǎng)幼蟲，每天觀察幼蟲生長發(fā)育和蛻皮情況，3 ～4 d 更換一次飼料，及時清理幼蟲的排泄物和食物殘渣。恒溫飼養(yǎng)條件為溫度(25 ±1)℃，相對濕度60% ～80%，光周期16 h 光照、8 h 黑暗。

供試藥劑:98%甲氧蟲酰肼原藥，美國陶氏益農公司產品，配置為100 mol·L－1的母液。乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G －250、氫氧化鋇、硫酸鋅，國藥集團化學試劑有限公司;對硝基苯甲醚、苯甲基磺酰氟、二硫蘇糖醇、硫脲、對硝基乙酰苯胺，美國Sigma 公司;還原型輔酶Ⅱ四鈉，瑞士Rocha 公司;磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉及其他試劑均為分析純。

毒力測定:采用葉片藥膜法［12－13］。甲氧蟲酰肼用丙酮液(V(丙酮)∶ V(蒸餾水)=2∶ 1)作為溶劑配成100 mol·L－1母液，之后用蒸餾水稀釋成0.1、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0、50.0 mol·L－1，每個梯度中丙酮溶劑含量均小于1%，以蒸餾水處理作為對照。將未接觸過任何藥劑的白樺葉片浸入稀釋好的藥液中，10 s 后取出，置于陰涼處晾干。用蘸有充足水分的脫脂棉裹住葉柄，放入透氣性良好的塑料培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中。將健康、大小一致，且饑餓12 h 的2、3 齡舞毒蛾幼蟲接到白樺葉片上，每齡每皿放入10 頭，每齡每個質量濃度重復3 次。置于人工智能培養(yǎng)箱內飼養(yǎng)，48 h 后檢查死亡數(shù)，以毛筆輕觸幼蟲不能活動視為死亡。

亞致死濃度處理:根據(jù)毒力測定結果，選用甲氧蟲酰肼48 h 的LC5和LC20劑量處理白樺葉片，飼喂健康、大小一致，且饑餓12 h 的2、3 齡舞毒蛾幼蟲，每齡每皿放入10 頭，處理方法和飼養(yǎng)條件同毒力測定，以蒸餾水處理作對照。處理6、12、24、48、72 h后，分別挑選活潑的2、3齡舞毒蛾幼蟲，于冰箱中－80 ℃儲存，用于酶活性測定。

酶活性測定:在用甲氧蟲酰肼處理后不同時間，每一處理每一重復取5 ～10 頭幼蟲，整體勻漿，測定不同處理時間MFOs 和羧基酰胺酶的活性。MFOs活性測定參考Hansen 等的方法［14］略作修改。取4×10－3mol·L－1對硝基苯甲醚1.0 mL，0.1 mol·L－1pH 值7.8 的磷酸緩沖液0.8 mL，5 ×10－4mol·L－1NADPH－Na40.2 mL 和酶液1.0 mL，以等體積的0.1 mol·L－1pH 值7.8 的磷酸緩沖液作對照，搖勻置于37 ℃水浴中反應30 min，然后在反應體系中加入1.0 mol·L－1鹽酸1.0 mL 終止反應，再加入5.0 mL 氯仿萃取，靜止10 min 后，在氯仿層移取3.0 mL 到另一組試管內，再加入0.5 mol·L－1氫氧化鈉3.0 mL溶液萃取，靜止10 min，取水相2.0 mL 于比色皿中，于400 nm 處測定OD 值。酶活力單位以mol·g－1·min－1表示。羧基酰胺酶活性測定參考Erlenger等的方法［15］略作修改。5 mL 反應體系中含有2 mL酶液(1 mg 蛋白)，0.1 mol·L－1pH 值7.5 的磷酸緩沖液2.9 mL，0.1 mL 5 g·L－1對硝基乙酰苯胺。用煮死的酶液作為對照。反應混合物于30 ℃恒溫水浴鍋中震蕩溫育30 min，將反應管于沸水中放置10 min 以終止反應，然后向所有反應管中加入1 mL 0.15 mol·L－1氫氧化鋇和0.15 mol·L－1硫酸鋅去除蛋白;于0 ℃、10 000 r/min 下離心15 min，吸取上清液在405 nm 處測定OD 值。酶活力單位以mol·g－1·min－1表示。酶的比活力(U/mg)=酶活力/蛋白質濃度。

蛋白質質量濃度測定:采用Bradford 考馬斯亮藍G－250 法［16］。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析:利用POLO 軟件處理分析毒力測定結果，計算致死中濃度(LC50)和亞致死濃度(LC5和LC20)及其95%置信區(qū)間;采用SPSS17.0軟件進行方差分析，差異顯著性檢驗采用LSD 法，顯著水平p=0.05 或p=0.01。

2 結果與分析

2.1 甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲的毒力

甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲致死中濃度及其95%置信區(qū)間見表1。甲氧蟲酰肼對舞毒蛾2、3 齡幼蟲均表現(xiàn)出較高的活性，2 齡幼蟲對藥劑較為敏感，48 h LC50為14.004 mol·L－1，而3 齡幼蟲48 h LC50則為24.105 mol·L－1。隨著齡期的增長，所需藥量增加，但是隨著處理時間的延長，LC50逐漸降低，96 h 時，2、3 齡幼蟲LC50分別降至2.150、2.835 mol·L－1。

2.2 甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲MFOs 活性的影響

甲氧蟲酰肼對舞毒蛾2 齡幼蟲MFOs 活性的影響見表2。72 h 內，LC5與LC20劑量下的甲氧蟲酰肼對舞毒蛾2 齡幼蟲體內MFOs 活性都具有先激活再抑制再激活的作用。處理6 h 時，處理組MFOs 活性均顯著高于對照組，分別為對照組的1.867、2.000倍(p ＜0.01);在處理12、24 h 時，MFOs 活性被抑制，其中LC5劑量下24 h 抑制作用最強，僅為對照的0.452 倍，與對照差異顯著(p ＜0.05);LC20劑量下12 h 抑制作用達到最大，為對照的0.500 倍，與對照差異顯著(p ＜0.05)。從處理48 h 開始，甲氧蟲酰肼對MFOs 活性具有明顯的激活作用，且均在處理72 h 時，LC5與LC20劑量對MFOs 的激活作用最強，分別為對照的6.143、4.571 倍，隨著時間的延長，藥劑對該酶激活作用呈上升趨勢。

表1 甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲的毒力 mol·L －1

表2 亞致死劑量甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲MFOs 活性的影響

由表2可以看出，甲氧蟲酰肼LC5和LC20對舞毒蛾3 齡幼蟲體內MFOs 活性的影響與對2 齡幼蟲該酶活性的影響具有相反的趨勢，即對MFOs 活性具有先抑制再激活再抑制的作用。處理6 h 時，MFOs 活性被抑制;處理12 h 時，MFOs 活性有所上升;處理后24 ～72 h，MFOs 活性再次被抑制，其中24 h 抑制作用最強，LC5和LC20處理下MFOs 活性分別為對照的0.160、0.115 倍，均與對照差異極顯著(p ＜0.01)。

2.3 甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲羧基酰胺酶活性的影響

從表3可以看出，用甲氧蟲酰肼48 h LC5和LC202 種劑量處理后，舞毒蛾2、3 齡幼蟲體內羧基酰胺酶呈激活—抑制—激活—抑制的曲線波動:處理6 h 時，羧基酰胺酶的活性明顯被激活;至12 h 時，羧基酰胺酶活性隨之被抑制;處理后24 ～48 h，該酶活性被再次激活，其中24 h 2 種劑量激活作用均達到最強。24 h 時，LC5劑量對舞毒蛾2、3 齡幼蟲激活作用分別為對照的1.409、1.148 倍，LC20劑量分別為對照的1.264、1.148 倍，均與對照差異極顯著(p ＜0.01)。隨著處理時間的延長，處理72 h 時，2種劑量對羧基酰胺酶的活性均表現(xiàn)出很強的抑制作用。72 h 時，LC5劑量下2、3 齡幼蟲的羧基酰胺酶活性分別為對照的0.668、0.729 倍，LC20劑量分別為對照的0.724、0.729 倍，均與對照差異極顯著(p ＜0.01)。

表3 亞致死劑量甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲羧基酰胺酶活性的影響

3 結論與討論

多功能氧化酶是昆蟲體內重要的解毒酶，在殺蟲劑代謝、昆蟲抗藥性等方面都具有重要作用［17－18］。王建軍等［7］在室內研究了甲氧蟲酰肼對斜紋夜蛾亞致死效應，結果表明甲氧蟲酰肼對MFOs 具有一定的誘導作用。廖月枝等［8］報道甲氧蟲酰肼對舞毒蛾4、6 齡幼蟲MFOs 表現(xiàn)為先抑制后誘導作用。本研究發(fā)現(xiàn)，甲氧蟲酰肼LC5和LC20對舞毒蛾2 齡幼蟲MFOs 活性均表現(xiàn)出先激活再抑制再激活效應，處理初期MFOs 活性被誘導激活，增強水解代謝達到解毒的目的;隨著處理時間的延長，當藥劑在幼蟲體內含量增加后，該酶活性逐漸被抑制，降低了幼蟲對該藥劑的解毒作用。2 種劑量對舞毒蛾3 齡幼蟲MFOs 的影響與2 齡幼蟲具有相反的趨勢，這與鄢杰明等［9］研究發(fā)現(xiàn)LC50劑量甲氧蟲酰肼對舞毒蛾3 齡幼蟲體內的MFOs 表現(xiàn)為先抑制后激活的作用具有一致性。這些變化都表明甲氧蟲酰肼對舞毒蛾2 齡和3 齡幼蟲體內MFOs 活性具有一定的干擾作用。昆蟲對具有酰胺鍵的某些有機磷化合物(如樂果)的抗性是由于對酰胺酶的誘導形成。Metcalf 等［19］報道鹽澤燈蛾幼蟲及蚊幼蟲對滅幼脲的降解，發(fā)生于滅幼脲分子中的酰胺鍵位點。吳剛等［20］研究證實小菜蛾體內酰胺酶對抑太保的降解作用，可能是導致其對抑太保產生抗性的重要機制。根據(jù)筆者的試驗結果，甲氧蟲酰肼對舞毒蛾2 齡和3 齡幼蟲體內羧基酰胺酶影響存在明顯的時間效應，具有類似的變化趨勢，即表現(xiàn)出激活—抑制—激活—抑制的趨勢，2 種劑量在24 h 對羧基酰胺酶的激活作用均達到最強，在72 h 對羧基酰胺酶的抑制作用達到最強。說明甲氧蟲酰肼能有效干擾舞毒蛾2 齡和3 齡幼蟲體內羧基酰胺酶的活性，從而干擾羧基酰胺酶對甲氧蟲酰肼的降解作用。綜上所述，甲氧蟲酰肼能有效干擾舞毒蛾低齡幼蟲體內MFOs和羧基酰胺酶的活性，干擾對甲氧蟲酰肼的降解作用，有效防治舞毒蛾。

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