落葉松毛蟲SOD 和CAT 對6 種農(nóng)藥的敏感性比較1)

劉哲強 焦 玥 王志英 鄒傳山

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

落葉松毛蟲(Dendrolimus superans (Butler))又稱西伯利亞松毛蟲，隸屬鱗翅目(Lepidoptera)枯葉蛾科(Lasiocampidae)。國內(nèi)分布于華北、東北及新疆北部，是我國東北林區(qū)的重要害蟲，主要危害落葉松(Larix spp.)、紅松(Pinus koraiensis)、油松(P.tabulaeformis)、樟子松(P. sylvestris var. mongolica)、云杉(Picea asperata)、冷杉(Abies fabric)等針葉樹種。該蟲暴發(fā)時吃光樹木針葉，形似火燒，甚至使松樹枯死［1］。化學(xué)防治能迅速降低蟲口密度，控制其傳播與蔓延，達到最佳控制效果，一直是防治落葉松毛蟲的有效措施之一。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)為昆蟲的重要保護酶。SOD 能將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，CAT 能將過氧化氫分解為水。因此，SOD 和CAT 可使細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除維持一種動態(tài)平衡，以防止自由基毒害［2］。目前，關(guān)于落葉松毛蟲SOD 和CAT 的研究尚未見報道。筆者測定了生產(chǎn)防治中常用的6 種農(nóng)藥對落葉松毛蟲離體和活體SOD 和CAT 活性的影響，研究了落葉松毛蟲在農(nóng)藥脅迫下體內(nèi)的生理變化，為有效防治落葉松毛蟲提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

落葉松毛蟲幼蟲于2009年6月采自內(nèi)蒙古自治區(qū)克什克騰旗芝瑞鎮(zhèn)落葉松人工林，并于(25 ±1)℃，光照周期為14 h 光照、10 h 黑暗，相對濕度75%的條件下用興安落葉松松針進行室內(nèi)人工飼養(yǎng)。

1.2 供試試劑及農(nóng)藥

甲硫氨酸(Met)、氮藍四唑(NBT)、核黃素(VB2)、苯基硫脲(N－phenylthiourea)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、考馬斯亮藍G －250 等均購于SIGMA 公司;磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮、三氯乙酸、過氧化氫和牛血清蛋白均為分析純。供試農(nóng)藥有25%滅幼脲(通化農(nóng)藥化工股份有限公司)、1.2%阿維菌素(黑龍江平山林業(yè)制藥廠)、40%辛硫磷(山東勝邦魯南農(nóng)藥有限公司)、2.5%高效氯氟氰菊酯(黑龍江平山林業(yè)制藥廠)、80%敵敵畏(山東高密市綠洲化工有限公司)、2.5%高效氯氰菊酯(山東大成農(nóng)藥股份有限公司)。

1.3 研究方法

酶液的制備:取5 ～6 頭落葉松毛蟲6 齡幼蟲，清除食道內(nèi)雜質(zhì)后用0.1 mol·L－1pH 7.5 的磷酸緩沖液(PBS)清洗體表，置于預(yù)冷的研缽中，加入10 mL 預(yù)冷PBS 緩沖液，于4 ℃、8 000 r·min－1下離心15 min，取上清液于4 ℃、12 000 r·min－1再次離心10 min，取上清液作為酶源。

SOD 活性測定:參照NBT 法［3－4］測定。反應(yīng)體系中含有80 μmol·L－1核黃素、77 μmol·L－1NBT、13 mmol·L－1MET、0.1 mmol·L－1EDTA 和50 μL酶液。于4 000 lx 下光照10 min 后遮光停止反應(yīng)，測定OD560，并測定酶液的蛋白質(zhì)含量，以NBT 被抑制50%為一個活性單位(U)，酶活性以U·min－1·mg－1表示，每組3 次重復(fù)。

CAT 活性測定:CAT 活性測定參照張友軍等的方法［5］。反應(yīng)體系含有0. 1 mol·L－1pH7. 0 的PBS、0.08% H2O2和50 μL 酶液，測定OD240，每30 S記數(shù)一次，共記錄3 min，計算OD240每分鐘的變化值。同時測定酶液的蛋白質(zhì)含量，OD240每減小0.1定為一個酶活單位(U)，酶活性以U·min－1·mg－1表示，每處理3 次重復(fù)。

離體SOD 活性的抑制測定:分別將6 種農(nóng)藥配制成0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 g·L－1。測定方法同SOD 活性測定。總反應(yīng)體積3.65 mL，3.00 mL反應(yīng)液加入0.05 mL 農(nóng)藥、0. 10 mL 稀釋酶液和0.50 mL VB2后于30 ℃、4 000 lx 下光照10 min，測定OD560，同時設(shè)定對照組，每處理3 次重復(fù)。

離體CAT 活性的抑制測定:測定方法同CAT活性測定。總反應(yīng)體積3.25 mL，3.00 mL 反應(yīng)液加入0.05 mL 農(nóng)藥和0.20 mL 稀釋酶液后，測定OD240每分鐘的變化值，同時設(shè)定對照組，每組3 次重復(fù)。

活體SOD 和CAT 活性的測定:分別將6 種農(nóng)藥配成0.001 g·L－1低質(zhì)量濃度，采用點滴法處理落葉松毛蟲6 齡幼蟲，點滴劑量為1 μL，分別處理12、48、72 h 后挑取活潑幼蟲用于酶活性測定，同時以點滴蒸餾水處理為對照。

蛋白質(zhì)含量測定:測定參照Bradford 的考馬斯亮藍G－250 法［6］。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Excel 2003 和SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析;酶活性抑制率=(對照活性－殘留活性)/對照活性×100%。以殺蟲劑濃度的負(fù)對數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)計算線性回歸方程，并通過線性方程求出IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藥對離體SOD 和CAT 活性的影響

高效氯氰菊酯、阿維菌素、滅幼脲和高效氯氟氰菊酯對離體SOD 均有不同程度的抑制作用，抑制率與質(zhì)量濃度成正比。而有機磷類農(nóng)藥(辛硫磷和敵敵畏)在低濃度(＜0.10 g·L－1)時表現(xiàn)出對離體SOD 誘導(dǎo)激活作用(見表1)。高效氯氰菊酯、阿維菌素、辛硫磷、敵敵畏、滅幼脲、高效氯氟氰菊酯對體外SOD 抑制中濃度依次為2. 41 × 10－3、2. 32 ×10－2、2.24 ×102、3. 36 ×103、9. 93 ×10－1、1. 53 ×10－2g·L－1;離體SOD 對6 種農(nóng)藥的敏感性由高到低依次為高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、阿維菌素、滅幼脲、辛硫磷、敵敵畏(表2)。Duncan 法多重比較結(jié)果表明，阿維菌素(0.01 g·L－1)、敵敵畏(＜0.05 g·L－1)處理SOD 活性與對照差異不顯著;高效氯氰菊酯和辛硫磷濃度小于0.05 g·L－1時，處理組SOD 活性顯著高于對照，而其余處理組的SOD活性顯著小于對照(見表1)。

表1 農(nóng)藥對落葉松毛蟲6 齡幼蟲離體SOD、CAT 的活性影響 U·min －1·mg －1

6 種農(nóng)藥對落葉松毛蟲6 齡幼蟲體外CAT 活性均有抑制作用，抑制程度存在明顯差異，抑制率與質(zhì)量濃度成正比(見表1)。高效氯氰菊酯、阿維菌素、辛硫磷、敵敵畏、滅幼脲和高效氯氟氰菊酯對體外CAT 抑制中濃度依次為1.21 ×105、18.32、4.79 ×105、1.36 ×107、0.44、47.92 g·L－1。其離體CAT對6 種農(nóng)藥的敏感性由高到低依次為滅幼脲、阿維菌素、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、辛硫磷、敵敵畏(見表2)。多重比較結(jié)果表明，利用高效氯氰菊酯(≤0.10 g·L－1)、阿維菌素(0.01 g·L－1)及辛硫磷(0.01 g·L－1)處理時，處理組CAT 活性與對照間差異不顯著;而其余處理CAT 活性顯著低于對照(見表1)。

2.2 農(nóng)藥對體內(nèi)SOD 和CAT 活性的影響

用0.001 g·L－1的6 種農(nóng)藥處理落葉松幼蟲12 h，結(jié)果表明，滅幼脲處理組SOD 活性高于對照，但差異不顯著，阿維菌素處理組低于對照，但差異也不顯著;而其它4 個農(nóng)藥處理組均顯著低于對照;其中高效氯氰菊酯處理組SOD 活性最低，僅為對照的0.628 倍;處理48 h，滅幼脲及阿維菌素2 個處理組的SOD 活性均顯著低于對照，辛硫磷處理組也低于對照，但差異不顯著;高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯處理組SOD 活性顯著高于對照，敵敵畏處理組也高于對照，但其差異不顯著;6 個處理中，滅幼脲處理SOD 活性最低，僅為對照的0.565 倍;高效氯氰菊酯處理SOD 活性最高，為對照的1.441 倍;處理72 h，敵敵畏和阿維菌素處理SOD 活性顯著高于對照，分別為對照的1.839、1.798 倍;滅幼脲處理SOD 活性為對照的1.030 倍，但差異不顯著;其余3種農(nóng)藥處理組的SOD 活性均低于對照，但與對照差異不顯著，其中高效氯氰菊酯處理SOD 活性最低，僅為對照的0.842 倍(見表3)。

表2 農(nóng)藥對離體SOD、CAT 活性的抑制中濃度

表3 農(nóng)藥對落葉松毛蟲6 齡幼蟲體內(nèi)SOD、CAT 活性影響 U·min －1·mg －1

6 種農(nóng)藥處理12 h，只有高效氯氟氰菊酯處理組的CAT 活性低于對照，但差異不顯著;阿維菌素處理組CAT 活性高于對照，但與對照間差異不顯著;而其余處理組的CAT 活性均顯著高于對照，其中滅幼脲處理組CAT 活性最高，為對照的1. 539倍;處理48 h，只有高效氯氰菊酯處理組CAT 的活性顯著低于對照，僅為對照的0.667 倍;敵敵畏處理組CAT 的活性略高于對照，但其差異不顯著;其它處理組CAT 的活性均顯著高于對照，其中高效氯氟氰菊酯處理組CAT 活性最高，為對照的1.600 倍;處理72 h，阿維菌素處理組CAT 活性最低且與對照差異顯著，僅為對照的0.520 倍;滅幼脲處理CAT活性略高于對照，但差異不顯著，其余處理組CAT活性均顯著高于對照，其中高效氯氟氰菊酯處理CAT 活性最高，為對照的1.485 倍(見表3)。

3 結(jié)論與討論

昆蟲體內(nèi)的SOD、POD 及CAT 在其生長發(fā)育、化學(xué)農(nóng)藥滲入、病原微生物侵染以及其他逆境中發(fā)揮著清除自由基、保護機體免受或減輕傷害的作用［7－10］。SOD 和CAT 活性與周圍環(huán)境(溫度、濕度、農(nóng)藥脅迫等)及食物等有密切關(guān)系。低溫促進麥紅吸漿蟲幼蟲(Sitodiplosis mosellana)SOD 和CAT的活力，而高溫卻導(dǎo)致其活力下降［11］;馬尾松毛蟲(Dendrolimus punctatus)取食受害新葉后馬尾松的CAT 活力上升［12］。此外，SOD 和CAT 活性與農(nóng)藥種類、濃度及處理時間存在必然聯(lián)系。雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)CAT 活性與馬拉硫磷的濃度和處理時間存在效應(yīng)關(guān)系［13］;天幕毛蟲(Malacosoma neustria testacea)4 齡幼蟲離體和活體SOD 比活力大小與高效氯氰菊酯、阿維菌素和辛硫磷的質(zhì)量濃度有關(guān)［14］。

本研究表明，高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯對落葉松毛蟲6 齡幼蟲離體SOD 活性抑制性最強，其IC50分別為2.41 ×10－3、1.53 ×10－2g·L－1。相對而言，敵敵畏和辛硫磷不僅對離體SOD 抑制性最弱，甚至在0.05 g·L－1質(zhì)量濃度以下時反而表現(xiàn)出對SOD 活性的誘導(dǎo)激活作用;滅幼脲和阿維菌素對CAT 活性的抑制能力大于其余類農(nóng)藥。6 種供試農(nóng)藥的低濃度劑量處理后，均打破了落葉松毛蟲6 齡幼蟲體內(nèi)自由基的平衡，并表現(xiàn)出明顯的時間效應(yīng)，其活性變化與外界刺激物相應(yīng)的強度有關(guān)，這是昆蟲為維持體內(nèi)平衡清除自由基的調(diào)節(jié)過程。在生物體正常的生理條件下，由于體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生的同時也被不斷清除，因而未表現(xiàn)出自由基對機體的明顯損傷。由于生物體內(nèi)某些生理作用或生化反應(yīng)需要O2的參與(如:清除入侵微生物)，由于O2參加反應(yīng)，致使其機體內(nèi)自由基不斷地產(chǎn)生，這時就需要SOD、CAT 等保護酶之間的協(xié)調(diào)作用來清除過多的自由基，從而使其體內(nèi)維持在有利無害、生理性低水平、穩(wěn)定平衡的自由基濃度［15－16］。由此可見，因農(nóng)藥種類的不同，刺激昆蟲體內(nèi)產(chǎn)生的自由基濃度也有一定差異。落葉松毛蟲6 齡幼蟲在面對不同農(nóng)藥脅迫時，為維持體內(nèi)的系統(tǒng)平衡，SOD 和CAT 活性隨農(nóng)藥刺激的強弱而變化，這也是昆蟲適應(yīng)逆境及抗藥性形成的主要機制之一。

［1］ 李莉，孟煥文，孫旭. 落葉松毛蟲生物學(xué)［J］. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，23(1):101 －103.

［2］ Fridovich I. Oxygen is toxic［J］. Bioscience，1977，27(7):462.

［3］ Beauchamp C O，F(xiàn)ridovich I. Superoxide dismutase:improved assays and an assay applicable to acrylamide gels［J］. Anal Biochem，1971，44:276 －287.

［4］ Malecka A，Jarmuszkewicz W，Omaszewska B. Antioxidative defense to lend stress in subcellular compartments of pea root cells［J］. Acta Biochimica Polonica，2001，48(3):687 －698.

［5］ 張友軍，王光鋒，吳青君，等.多殺菌素對不同發(fā)育階段甜菜夜蛾的毒力及其體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的影響［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2003，5(3):31 －38.

［6］ Bradford M M. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］. Anal Biochem，1976，72:255 －260.

［7］ 馮從經(jīng)，戴華國，武淑文.褐飛虱高溫條件下應(yīng)激反應(yīng)及體內(nèi)保護酶系活性的研究［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2001，12(3):409 －413.

［8］ 馬志卿，欒正春，張興.松油烯－4 －醇對淡色庫蚊的熏蒸毒力及對其Na+，K+－ATP 酶的抑制作用［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2009，11(2):230 －234.

［9］ 張仙紅，王宏民，李文英，等.菜青蟲感染玫煙色擬青霉后血淋巴蛋白質(zhì)含量及幾種保護酶活力的變化［J］.昆蟲學(xué)報，2006，49(2):230 －234.

［10］ 張月亮，慕衛(wèi)，陳召亮，等. 桃小食心蟲幼蟲越冬前后對幾種殺蟲劑敏感性的差異［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2007，18(8):1913－1916.

［11］ 成衛(wèi)寧，王洪亮，李怡萍，等. 麥紅吸漿蟲滯育發(fā)生和解除過程中保護酶活力動態(tài)［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，19(8):1764－1768.

［12］ 戈峰，李典謨，邱業(yè)先，等. 松樹受害后一些化學(xué)物質(zhì)含量的變化及其對馬尾松毛蟲種群參數(shù)的影響［J］. 昆蟲學(xué)報，1997，40(4):337 －342.

［13］ 呂林蘭，董學(xué)興，黃金田，等. 馬拉硫磷對雙齒圍沙蠶抗氧化酶的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(11):5719 －5722.

［14］ 查黎春，胡春祥，曹傳旺，等.3 種農(nóng)藥對天幕毛蟲超氧化物歧化酶活性的影響［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，39(5):105 －107.

［15］ 方允中，劉智峰，李益新，等. 化學(xué)發(fā)光法測定超氧化物歧化酶的動力學(xué)研究［J］.科學(xué)通報，1986(5):356 －359.

［16］ 李培峰，方允中.過氧化氫對銅鋅超氧化物歧化酶活性及某些理化性質(zhì)的影響［J］. 生物化學(xué)雜志，1993，9(4):411 －416.