櫻桃根際促生細(xì)菌YT3 的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化1)

馬海林 邢尚軍 劉方春 馬丙堯 丁延琴 陳 波 杜秉海

(山東省森林植被生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心(山東省林業(yè)科學(xué)研究院)，濟(jì)南，250014) (山東農(nóng)業(yè)大學(xué))

植物根際促生菌(PGPR)是指生存于植物根際、根表，對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)或?qū)Σ≡修卓棺饔玫挠幸婕?xì)菌的統(tǒng)稱［1－3］。大量文獻(xiàn)證明，PGPR 對(duì)植物生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用［4－5］。PGPR 菌株產(chǎn)生的植物激素可增強(qiáng)根系吸收礦物營(yíng)養(yǎng)和水分的能力，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。同時(shí)PGPR 在根圍的定殖能力在一定程度上能抑制病原物的定殖和傳播。假單胞菌(Pseudomonas spp.)是一類良好的植物根際促生細(xì)菌，具有分布廣、數(shù)量多、營(yíng)養(yǎng)需要簡(jiǎn)單、繁殖快、競(jìng)爭(zhēng)定殖力強(qiáng)的特點(diǎn)。它們可分解葡萄糖、產(chǎn)接觸酶、產(chǎn)氧化酶、還原硝酸鹽，可通過聯(lián)合固氮、溶磷、產(chǎn)生鐵載體、產(chǎn)植物激素等多種機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)［6－7］。

接種土壤微生物，特別是接種PGPR，被普遍認(rèn)為是一種環(huán)境友好經(jīng)濟(jì)有效的提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的方法［2，5］。生物有機(jī)肥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求貯存至第180 天時(shí)，有效活菌數(shù)＞0.2 億CFU·g－1，水分＜30%［8］。若發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)較低，接種時(shí)發(fā)酵液的用量較大，易導(dǎo)致生物有機(jī)肥料的含水量過高。因此，提高發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)是生物有機(jī)肥料研制和生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。關(guān)于不同微生物發(fā)酵條件優(yōu)化的報(bào)道很多，雷娟等人篩選出一株對(duì)青枯假單胞菌，通過發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)，確定該菌株的最佳發(fā)酵配方為:蔗糖8.00%、大豆粉5.00%、NaNO31.00%、NaCl0.20%、CaCO30.40%、K2HPO40.08%;最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 值7.0，30 ℃，恒溫?fù)u床200 r/min［9］。韓麗等采用單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法研究了生防菌株B26 液體發(fā)酵條件［10］;鄭艷等以選育的洋蔥假單胞菌TG －15 －03 為生產(chǎn)菌株，考察了不同發(fā)酵條件對(duì)乳糖酸產(chǎn)量的影響［11］。本研究選用的假單胞菌YT3(菌種保藏號(hào)CGMCC No.5319)篩選于櫻桃根系，經(jīng)試驗(yàn)證明具有較好的促生作用，對(duì)于促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)、活化土壤養(yǎng)分具有積極作用，具備開發(fā)微生物肥料的潛力［12－13］，目前還沒有關(guān)于YT3 的發(fā)酵條件優(yōu)化的研究。因此，筆者采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)YT3菌株液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到其最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以期為該菌株的工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

試驗(yàn)用生物材料YT3 是從櫻桃根際土壤篩選出的1 株根際促生細(xì)菌，通過對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定以及16S rDNA 序列及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為假單胞菌，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No.5319)［13］。

1.2 主要培養(yǎng)基

檢測(cè)培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂2.0%，pH=7.0 ～7.2。

種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，pH=7.0 ～7.2。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖1. 00%，硫酸銨0.20%，磷酸氫二鉀0.30%，MgSO4·7H2O 0.02%，氯化鈣0.01%，pH=7.0 ～7.2。

1.3 主要設(shè)備

DPN－9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，1 000 倍微生物顯微鏡(徠卡)，PHSJ －4A 型pH 計(jì)，THZ －C 恒溫振蕩器，超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，TU－1810 型紫外可見分光光度計(jì)。

1.4 培養(yǎng)方法

菌種活化:將斜面保存的YT3，轉(zhuǎn)接到NA 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。

YT3 的生長(zhǎng)曲線測(cè)定:挑菌至含10 mL NA 液體培養(yǎng)基的試管中，調(diào)pH 值為7.0，37 ℃、200 r/min，搖床培養(yǎng)。分別于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h取出，放入冰箱4 ℃保存。用未接種的NA 培養(yǎng)液作空白對(duì)照，在600 nm 下測(cè)定OD 值。

發(fā)酵培養(yǎng):100 mL 三角瓶中裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，接種量5%(接種量試驗(yàn)除外)，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.5 培養(yǎng)基的優(yōu)化

采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以不同碳源(3%蔗糖、3%葡萄糖、3%乳糖、3%可溶性淀粉和3%玉米淀粉)和不同氮源(1.5%蛋白胨、1.5%牛肉膏、1.5%酵母膏、1.5%硝酸鈉、1.5%氯化銨和1.5%尿素)替代培養(yǎng)基中的碳、氮源，其他成分不變，測(cè)定活菌數(shù)。每處理3 個(gè)重復(fù)。采用正交表L9(34)安排試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方，明確碳源、氮源、K2HPO4和MgSO4·7H2O 的最佳添加量，每處理3 個(gè)重復(fù)。以正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因子試驗(yàn)，測(cè)定不同溫度、起始pH、不同轉(zhuǎn)速和接種量對(duì)生長(zhǎng)量的影響。

1.6 分析方法

活菌計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法;采用TU －1810 型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定600 nm 下菌懸液的光密度;pH 的測(cè)定采用數(shù)字式pH 計(jì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

發(fā)酵液中的活菌數(shù)及600 nm 下的OD 值的顯著性檢驗(yàn)采用Excel 2007 和SPSS 軟件進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果為3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 YT3 的生長(zhǎng)曲線

從YT3 生長(zhǎng)曲線(圖1)可以看出，YT3 的生長(zhǎng)規(guī)律可大體分為3 個(gè)階段，生長(zhǎng)延滯期，對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期。培養(yǎng)初期，鏡檢菌體數(shù)量較少，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鏡檢菌體數(shù)量快速增加，生長(zhǎng)后期，菌體數(shù)量趨于平穩(wěn)。為了揭示YT3 的生長(zhǎng)規(guī)律，用Logistic生長(zhǎng)函數(shù)對(duì)YT3 的生長(zhǎng)進(jìn)行擬合，其擬合方程的線性相關(guān)系數(shù)為0.9564，達(dá)極顯著水平，可見，菌株生長(zhǎng)的過程呈不對(duì)稱的S 曲線形狀增長(zhǎng)。Logistic 生長(zhǎng)函數(shù)模型的特征值可反映菌株長(zhǎng)過程中的一些特征，根據(jù)模型系數(shù)求得菌株快速生長(zhǎng)開始時(shí)間(始盛期，Ta)和結(jié)束時(shí)間(盛末期，Tb)及最大增長(zhǎng)速度出現(xiàn)時(shí)間(Tm)［14－15］。可以看出，培養(yǎng)初期(0 ～3 h)，YT3 處于延滯生長(zhǎng)期，鏡檢菌體數(shù)量較少;菌株快速生長(zhǎng)的始盛期和盛末期分別為第3 小時(shí)和第12 小時(shí)，意味著培養(yǎng)至3 ～12 h 時(shí)，YT3 處于對(duì)數(shù)期，鏡檢菌體數(shù)量急劇增多。12 h 以后，菌體數(shù)量趨于平穩(wěn)。生產(chǎn)中通常選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(快速增長(zhǎng)期)的菌體作為種子，此時(shí)的種子既保有旺盛的增殖能力，又達(dá)到高濃度，以縮短發(fā)酵周期。因此，選定YT3 的適宜種齡是12 h。

圖1 假單胞菌YT3 生長(zhǎng)曲線的Logistic 模型及其特征值

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源和氮源篩選

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源分別用3%蔗糖、3%葡萄糖、3%乳糖、3%可溶性淀粉和3%玉米淀粉代替，制成培養(yǎng)基后，調(diào)pH 值7.0。接種5%種子液，37 ℃、200 r/min，搖床24 h，測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)(表1)?？梢钥闯?，同其他碳源相比，乳糖作為碳源的活菌數(shù)顯著高于其他碳源，蔗糖次之。

表1 不同碳源對(duì)YT3 生長(zhǎng)量的影響

將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源分別用1.5%蛋白胨、1.5%牛肉膏、1.5%酵母膏、1.5%硝酸鈉、1.5%氯化銨和1.5%尿素代替，基本培養(yǎng)條件同上，測(cè)發(fā)酵液中的活菌數(shù)(表2)。可以看出，蛋白胨作為氮源的活菌數(shù)顯著高于其他氮源，這說明蛋白胨是最適氮源。

表2 不同氮源對(duì)YT3 生長(zhǎng)量的影響

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在確定了碳源和氮源種類的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)基本條件不變，以乳糖、蛋白胨、K2HPO4、MgSO4·7H2O 作為培養(yǎng)基的因素，每個(gè)因素取3 個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9(34)的正交試驗(yàn)(表3)。不同試驗(yàn)處理中培養(yǎng)基的活菌數(shù)分別為29. 5 ×108、39.5 ×108、40.0 ×108、16.5 ×108、45.5 ×108、51.5 ×108、14.5 ×108、25.0 ×108、28.0 ×108CFU/mL。通過表4中的R 值可以看出，影響YT3 活菌數(shù)的主要因素是蛋白胨，其次為乳糖，K2HPO4和Mg-SO4·7H2O 影響較小。不同試驗(yàn)處理的活菌數(shù)差異達(dá)顯著水平，假單胞菌YT3 發(fā)酵的適宜條件為乳糖2. 00%，蛋 白 胨2. 00%，K2HPO40. 15%，Mg-SO4·7H2O 0.02%，CaCl20.01%。在此培養(yǎng)基條件下，YT3 菌株的最高活菌數(shù)可達(dá)51.5 ×108CFU/mL，顯著高于其他試驗(yàn)處理。

表3 不同因素配比對(duì)YT3 菌落影響的正交設(shè)計(jì) %

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

溫度對(duì)生長(zhǎng)量的影響:搖床溫度分別設(shè)為20、25、30、34、37、40 ℃，將培養(yǎng)基的初始pH 調(diào)至7.0，200 r/min 搖瓶培養(yǎng)24 h，測(cè)定其600 nm 時(shí)的OD值。由表5可知，溫度對(duì)YT3 的菌濃度有著顯著影響。隨著溫度的增加，YT3 的菌濃度先增加后減少，在34 ℃時(shí)OD 值最大，菌液濃度最高。

表4 不同因素配比對(duì)YT3 菌落影響的正交試驗(yàn)極差分析CFU·mL －1

表5 不同溫度對(duì)生長(zhǎng)量的影響

起始pH 值對(duì)生長(zhǎng)量的影響:由于搖瓶發(fā)酵過程中pH 難以控制，因此只能控制發(fā)酵液的初始pH。將培養(yǎng)基的初始pH 分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.8，于37 ℃，200 r/min 搖瓶培養(yǎng)24 h，用分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值(表6)。結(jié)果表明，pH 對(duì)菌液濃度影響顯著，同溫度影響基本一致，隨著pH 值的增加，YT3 的菌濃度先增加后減少，pH值6.5 時(shí)，OD 值顯著高于其他處理。

表6 不同pH 對(duì)生長(zhǎng)量的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)生長(zhǎng)量的影響:YT3 發(fā)酵是需氧性發(fā)酵過程，通過改變搖床轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)通氣量。轉(zhuǎn)速太小，通氣量小，不利于菌體生長(zhǎng);但轉(zhuǎn)速太大，可能會(huì)引起菌體自溶，使生物量減少。搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)為150、180、200、220、250 r/min，分別測(cè)定不同轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響，發(fā)酵液初始pH 調(diào)至7.0，搖床溫度37 ℃，搖瓶培養(yǎng)24 h，用分光光度計(jì)在600 nm 測(cè)定OD 值(表7)?？梢钥闯?，轉(zhuǎn)速同樣對(duì)YT3菌液濃度影有較大影響，轉(zhuǎn)速為180 r/min 時(shí)，OD值最大。當(dāng)轉(zhuǎn)速低于或高于180 r/min 時(shí)，均會(huì)導(dǎo)致OD 值的顯著下降。

表7 不同轉(zhuǎn)速對(duì)生長(zhǎng)量的影響

接種量對(duì)生長(zhǎng)量的影響:在37 ℃，初始pH 值7.0，轉(zhuǎn)速200 r/min 條件下，接種量分別采用1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%，用分光光度計(jì)在600 nm 測(cè)定OD 值(表8)?？梢钥闯?，在接種量濃度較低時(shí)，菌液濃度隨著接種量的增加逐漸增加。方差分析結(jié)果顯示，當(dāng)接種量濃度達(dá)到9%時(shí)，OD 值基本達(dá)最大。接種量濃度增加到11%時(shí)，OD 值雖然有所增加，但差異不顯著。當(dāng)接種量濃度為13%時(shí)開始顯著降低。

表8 接種量對(duì)生長(zhǎng)量的影響

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，細(xì)菌發(fā)酵液中的活菌數(shù)主要受發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件(溫度、pH、接種量和搖床轉(zhuǎn)速等)的影響［13，16－17］。植物根際促生細(xì)菌對(duì)植物生長(zhǎng)具有一定的刺激作用［1－5］。假單胞菌YT3是山東省林科院和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)從櫻桃根際土壤中篩選出的一株植物根際促生細(xì)菌，細(xì)菌發(fā)酵液可產(chǎn)反式玉米素、激動(dòng)素和吲哚乙酸等不同的植物激素，在生物有機(jī)肥的生產(chǎn)與研制過程中具有較大的應(yīng)用潛力。本研究首次對(duì)櫻桃根際促生細(xì)菌YT3 的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化進(jìn)行了研究。結(jié)果證實(shí)不同的發(fā)酵培養(yǎng)條件均會(huì)影響到細(xì)菌發(fā)酵液中的活菌數(shù)量，這與大量的研究結(jié)果相吻合［13，17］。通過單因子試驗(yàn)最終確定最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基溫度34 ℃，初始pH 值6.5，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，接種量9%。此外，同前人對(duì)不同菌株的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分相比較［9－11］，不同種類菌株之間差異很大。

細(xì)菌培養(yǎng)中，碳源和氮源的種類對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有著很大影響，這與文獻(xiàn)報(bào)道的觀點(diǎn)相一致［17－18］。YT3 的最佳碳源和氮源分別為乳糖和蛋白胨。同樣，碳源和氮源含量對(duì)細(xì)菌發(fā)酵液中的菌液濃度影響很大。過多的速效碳源會(huì)加速菌體呼吸，消耗過多氧氣而不利于菌體生長(zhǎng)，使菌體代謝過快，導(dǎo)致細(xì)菌后續(xù)生長(zhǎng)缺乏營(yíng)養(yǎng)［18］。研究表明，氮源對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有極顯著作用，氮源不足，影響菌體生長(zhǎng)［18］。通過正交試驗(yàn)，確定YT3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方為乳糖和蛋白胨以2%為宜。相對(duì)于碳源和氮源而言，MgSO4·7H2O 和CaCl2對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)影響較小，其適宜添加比例為MgSO4·7H2O 0.02%和CaCl20.01%。

細(xì)菌發(fā)酵液中活菌數(shù)的高低是研制生物有機(jī)肥的關(guān)鍵因素。在適宜條件下，YT3 菌株的最高活菌數(shù)可達(dá)51.5 ×108CFU/mL，從而確定YT3 完全可用于生物肥料的生產(chǎn)。在有機(jī)載體中僅吸附0.5%的YT3 發(fā)酵液即可達(dá)到生物有機(jī)肥的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［10］。因此，即使有機(jī)物料的吸水能力較差，也可以作為YT3的吸附載體使用。實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)酵條件的選擇除了考慮有效活菌數(shù)的數(shù)量以外，還要綜合實(shí)際生產(chǎn)中能耗、材料消耗量、機(jī)器磨損量等方面的考慮。

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