不同花色野生百合色素成分分析1)

夏 婷 耿興敏 羅鳳霞

(南京林業(yè)大學，南京，210037) (金陵科技學院)

在百合育種中，花色是衡量百合觀賞價值的一個重要標準。國外有關百合花色的研究已有大量報道。Banba 等在有關日本百合色素資源的調查中發(fā)現大多數亞洲百合中的黃色和橙色百合中主要含有類胡蘿卜素，粉色百合主要含有花青素，而百合花瓣中的花斑也主要是由花青素引起的［1－2］。根據亞洲百合和東方百合的10 個雜交品種的花色素苷成分分析結果，可以看出，百合紅色花瓣中主要含有原花青素、矢車菊色素3－O－β 蕓香糖苷7 －O－β －葡糖苷和矢車菊色素3－O－β 蕓香糖苷，而非白色花瓣中總含有原花青素［3］。近年來，國外在百合花色成分分析研究的基礎上，對百合花色的分子遺傳機理和基因調控等已有大量報道。研究表明，花青素苷的合成是由一對顯性基因控制的，并且花瓣與花斑中花色素苷的合成是獨立遺傳的，而類胡蘿卜素的合成受多個基因的影響［4－6］。查爾酮合酶(CHS)和黃烷酮醇4 －還原酶(DFR)是控制亞洲雜交系百合的花瓣及花斑花色素苷累積形成的關鍵酶［4］，R2R3 －MYB 類轉錄因子LhSorMYB12 控制了東方系百合索邦的花色素合成，且與東方系百合花瓣顏色不同相關［7］。

我國有約47 個種18 個變種，其中36 個種15個變種為我國特有種［8］，占世界野生百合資源的半數以上，種類及花色資源非常豐富。但對中國野生百合的色素資源調查、色素成分的鑒定、分離、結構分析等還未見報道。因此，本研究以中國野生百合4 個組13 個種為主要試驗材料，對其花色、基本色素成分進行了初步分析，為其色素成分的進一步定性、定量分析提供理論依據，為我國花色育種提供理論基礎及參考依據，從而促進我國百合的花色育種進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2009年和2010年秋季陸續(xù)收集到分屬百合屬4 個組的13 個種的種球，然后栽植于南京林業(yè)大學溫室。具體種類、分類及來源見表1和圖1。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同花色百合的花色測定

在百合盛開狀態(tài)下，每個種隨機選取5 個不同單株，取新鮮花瓣，在室內自然光條件下，將花瓣最寬部分與英國皇家園藝學會比色卡(RHSCC)進行對比。同時，用色差儀(NF333 spectrophotometer，Nippon denshoku，光源C/2°)測量花瓣最寬部分的亮度L*和兩個色度成分a*值(從綠色到紅色)及b*值(從藍色到黃色)，取平均值。使用國際照明委員會(International Commission on Illumination，CIE)系統進行分析。色度C*=(a*2+b*2)1/2和色度角h=arctan(b*/a*)。

表1 試驗材料

圖1 百合種類

1.2.2 不同花色百合的顯色反應

每個種隨機選擇5 個單株，取下花瓣，去除花斑部分，剪碎后混勻，分別取0.1 g 新鮮花瓣，用10%鹽酸和石油醚研磨過濾，觀察研磨液的顏色變化。百合的花斑部分單獨測試。同時用25%氨水進行氣熏，觀察百合花瓣顏色變化［9－10］。

1.2.3 不同花色百合的紫外光譜分析

收集盛花期花瓣，去掉中梗，剪碎，分裝成3.5 g左右的小袋，用液氮速凍后放入－85 ℃貯藏。注意將帶花斑的百合，花斑部分和不帶花斑部分分開剪裝。所有樣品收集完后，統一用冷凍干燥機干燥。干燥后的花瓣樣品，放入冰箱－25 ℃干燥保存待用。各色素成分樣品分析均使用0.02 g 干燥花瓣。

花瓣中葉綠素的檢測:用V(丙酮)∶ V(乙醇)=9∶ 1 溶液提取，過濾并定容至5 mL。用島津公司生產的UV—1700 型紫外可見分光光度計在400 ～700 nm 掃描，比色皿光徑為1 cm。葉綠素的特征吸收峰出現在662、644 nm 附近［11］。

花瓣中類胡蘿卜素的檢測:用V(石油醚)∶ V(丙酮)=1 ∶ 1 溶液提取，過濾定容至6 mL。在200 ～700 nm 掃描。類胡蘿卜素的特征吸收峰出現在440、470 nm 附近［11］。

花瓣中類黃酮的檢測:黃色系和白色系的樣品加鹽酸化甲醇(pH =3)2 mL 置于冰箱中4 ℃提取24 h;紅色系、紫色系、粉色系和橙色系加V(HCl)∶V(MeOH)=1∶ 99 混合液2 mL 放在常溫下(大約25 ℃)避光提取24 h。過濾定容至10 mL，在220 ～600 nm 掃描。黃酮類化合物一般有2 個吸收帶，分別是240 ～285 nm 和300 ～550 nm。甲醇溶劑提取的花色素苷最大吸收波長在520 ～560 nm［11－12］。

1.2.4 不同花色百合類黃酮的特征顯色反應

稱取干燥的花瓣粉末0. 1 g，用V(HCl)∶ V(MeOH)=1∶ 99 的鹽酸化甲醇溶液提取15 h，過濾并定容至25 mL，備用［13－15］。

濃鹽酸—鎂粉反應:取2 mL 提取液，加入少量鎂粉并加5 滴濃鹽酸，搖勻，靜置1 h。

濃鹽酸—鋅粉反應:取2 mL 提取液，加入少量鋅粉并加10 滴濃鹽酸，搖勻，靜置1 h。

金屬鹽類試劑的絡合反應:三氯化鋁反應，取2 mL 提取液，加1.0%的AlCl3·6H2O 甲醇溶液1 mL。

醋酸鉛反應:取2 mL 提取液，加1. 0% 的Pb(CH3COO)·3H2O 溶液2 mL，搖勻，靜置2 h。

氨性氯化鍶反應:取2 mL 提取液，加10 滴0.01 mol·L－1的SrCl2·6H2O 甲醇液，再加10 滴被氨水飽和的甲醇液(取甲醇10 mL，加氨水定容至25 mL)，搖勻，靜置1 h。

三氯化鐵反應:取2 mL 提取液，加5. 0% 的FeCl3·6H2O 溶液2 mL。

硼酸反應:取2 mL 提取液，加10 滴1.0%的H2O2C4·2H2O 溶液，再加3 mL 2. 0%的H3BO3溶液。

2 結果與分析

2.1 不同花色百合的花色測定結果

根據比色卡比較結果以及色差“CIELAB”分布(表2、圖2)，將試驗中所用百合初步分為四大色系:橙色系(O)包括毛百合、有斑百合、細葉百合、蘭州百合、卷丹、大花卷丹、輪葉百合;紫色系(P)包括鹿子百合、垂花百合;黃色系(Y)包括通江百合(2009)、岷江百合(下部);白色系(W)包括岷江百合(上部)、寶興百合、通江百合(2010)、鐵炮百合。雖然，岷江百合花瓣基部呈現黃色，但仍將其歸于白色系(W)。2009年收集的通江百合，收獲子球，在第二年栽植后，或許因種球的退化及環(huán)境的不適應性，花色變淺，基本呈白色。

表2 百合花色測定結果

圖2 不同花色百合的“CIELAB”分布

2.2 不同花色百合的顯色分析結果

氨水、10% HCl 及石油醚顯色反應結果如表3所示。觀察石油醚研磨過濾液顏色，橙色系的所有百合、白色系的岷江百合下部的過濾液呈現不同程度黃色，說明其含有類胡蘿卜素，其中有斑百合類胡蘿卜素含量較高，其次是毛百大花卷丹和輪葉百合等，而蘭州百合、卷丹的類胡蘿卜素含量較低。觀察10% HCl 研磨過濾液顏色，紫色系的百合顯色結果表明其含有花青素，紫色系的鹿子百合和垂花百合氨水氣熏后花瓣顏色變綠，是由花色苷呈現的藍色和類黃酮呈現的黃色混合而成，說明其同時含有類黃酮和花青素苷，而鹿子百合的花瓣白色邊緣變黃，說明其含有黃酮色素;白色系百合及黃色系百合的百合花瓣氨水測試中也顯色不同程度的黃色，說明其可能含有黃酮或黃酮醇色素?；ò卟糠?0%HCl 研磨過濾液顏色顯紅色，說明其含有花青素，氨水測試后顏色發(fā)藍黑色，進一步說明其含有花色素苷(數據未顯示)。

表3 不同百合的顯色反應結果

2.3 不同花色百合的紫外掃描分析

不同花色百合的紫外掃描結果如表4所示。橙色系的輪葉百合、白色系的岷江百合(下部)、鐵炮百合、通江百合(2010)以及黃色系(2009)的紫外掃描時，均在662 nm 附近出現了吸收峰，雖然吸收值很微小，但還是說明這些百合花瓣中含有微量的葉綠素，這也或許因為取樣時靠近花瓣中脈部分所致。

橙色系所有百合，白色系的岷江百合(下部)，黃色系的通江百合(2009)、黃百合在440、470 nm 附近都有吸收峰，說明這些百合的花瓣中含有類胡蘿卜素。白色系的鐵炮和通江百合(2010)在440 nm附近有吸收峰，但吸收值很小，說明可能含有微量類胡蘿卜素。這在石油醚顯色反應中沒被觀測到，或許與類胡蘿卜素的含量較低有關，也說明通江百合在第2年栽植時花色變淺可能與花瓣中類胡蘿卜素含量減少有關。

紫色系的所有百合在530 nm 附近均出現了吸收峰，說明這些百合花瓣中均含有花色素苷。所有百合均在240 ～285 nm 和300 ～550 nm 出現吸收峰，說明上述百合花瓣中含有其他類黃酮化合物。

2.4 不同花色百合的類黃酮特征顯色分析結果

不同花色百合的類黃酮特征顯色反應結果如表5所示。

2.4.1 還原反應

橙色系的毛百合、有斑百合、卷丹、大花卷丹、輪葉百合，紫色系的鹿子百合、垂花百合，白色系的岷江百合(上部)、寶興百合、通江百合(2010)以及黃色系的通江百合(2009)與濃鹽酸加鎂粉或鋅粉反應呈現橙紅～紫紅色，說明可能含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物。結合單獨濃鹽酸反應做對照，紫色系的鹿子百合、垂花百合及其他色系帶花斑的百合花斑部分均出現不同程度的紅色，說明其含有花色素。

2.4.2 金屬鹽類試劑的絡合反應

三氯化鋁反應:白色系的寶興百合、岷江百合(上、下部分)、鐵炮百合、通江百合(2010)及黃色系的通江百合(2009)表現為極淡黃色，意味著黃酮的存在。

醋酸鉛反應:橙色系的毛百合、有斑百合、細葉百合、蘭州百合、卷丹、大花卷丹、輪葉百合，紫色系的鹿子百合、垂花百合均出現黃至紅色沉淀，說明其具有鄰二酚羥基或兼有3—OH，4 ＝O 或5—OH，4 ＝O 的化合物，并表明了其不含查耳酮和橙酮。

氨性氯化鍶反應:橙色系的卷丹、大花卷丹，紫色系的鹿子百合、垂花百合，白色系的鐵炮百合，產生了黃色、綠色～棕色沉淀，意味著色素分子中有鄰二酚羥基結構的黃酮類化合物。

三氯化鐵反應:多數黃酮類化合物因分子中含有游離酚羥基，與三氯化鐵水溶液或醇溶液可產生陽性反應，呈現顏色;當含有氫鍵締合的酚羥基時，顏色更明顯。紫色系的鹿子百合、垂花百合，白色系的岷江百合(上、下部分)、通江百合(2009，2010)、寶興百合、鐵炮百合反應溶液均出現了不同程度的綠色，說明其黃酮類化合物含有酚羥基。

表4 不同百合花瓣中葉綠素、類胡蘿卜素及類黃酮紫外掃描特征吸收峰

表5 不同顏色百合的類黃酮特征顯色反應

2.4.3 硼酸反應

所有色系的百合與硼酸反應均未出現亮黃色，說明所有百合均不含有5 －羥基黃酮及2’－羥基查爾酮。

3 結論與討論

本研究所用的13 種不同花色百合主要被劃分為4 個色系:橙色系、紫色系、白色系和黃色系。同一色系的品種其花瓣顏色深淺、亮度(測定值未顯示)等也存在很大差異。

不同花色的色素成分存在差異，但光譜掃描結果顯示，所有百合花瓣都含有類黃酮化合物(不包括花色素苷)。石油醚顯色反應和光譜掃描結果均說明橙色系百合色素主要由類胡蘿卜素構成，這與Nakano et al.［6］研究發(fā)現亞洲雜交百合中橙色與黃色百合中主要含有類胡蘿卜素一致。而還原反應則顯示有斑百合、卷丹、大花卷丹和輪葉百合可能還含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物。10%鹽酸顯色反應和光譜掃描結果表明紫色系百合花瓣主要含有花色素苷，這與張圓圓等［16］通過對不同花色向日葵檢測以及張潔等［17］對顯現不同程度紅色貼梗海棠檢測發(fā)現花色素苷是紅色及紫色的主要色素成分結論一致。氨水測試則表明其還同時含有類黃酮物質，通過還原反應進一步分析表明這些類黃酮物質可能是黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物。還原反應結果顯示白色系和黃色系百合(除鐵炮百合外)花瓣也含有以上類似物質，三氯化鋁試劑的絡合反應則進一步表明岷江百合、通江百合及鐵炮百合花瓣含有黃酮色素，氨水測試反應中白、黃色系的百合花瓣呈現不同程度的黃色，說明其含有黃酮或黃酮醇。岷江百合下部黃色的花瓣中還檢測到類胡蘿卜素的存在。另外，光譜掃描結果還顯示鐵炮百合和2009年栽培的通江百合中含有少量的類胡蘿卜素，但峰值不明顯，可能是其含量較低的原因。輪葉百合、鐵炮百合、通江百合(2010 栽培)等部分百合花瓣中還檢測到了極微量的葉綠素存在，也可能取樣部位接近葉脈所致，這需要進一步的分析。

所有帶花斑的百合花瓣均檢測到花色素苷的存在，這與之前學者的研究一致［4］。百合花色通常有多種色素共同顯色所致，特征顯色反應和紫外分光光度計掃描只是對百合花色的初步定性分析，還需要結合高效液相色譜、質譜、核磁共振等方法對色素的成分進行進一步分析。另外，在本研究中收集材料有限，中國野生百合中還有很多珍惜花色品種，如綠花百合(Lilium fargesii)、紫花百合(Lilium souliei)等，還有待于進一步的分析、研究。

［1］ Banba H. Pigments of lily flowers I. survey of anthocyanin (in Japanese)［J］. Jpn Sci Hort Sci，1967，36(4):433 －437.

［2］ Banba H. Pigments of lily flowers Ⅱ. Survey of carotenoid (in Japanese)［J］. Jpn Sci Hort Sci，1968，37(4):72 －82.

［3］ N?rbaek R，Kondo T. Anthocyanins from flowers of Lilium (Liliaceae)［J］. Phytochemistry，1999，50:1181 －1184.

［4］ Abe H，Nakano M，Nakatsuka A，et al. Genetic analysis of floral anthocyanin pigmentation traits in Asiatic hybrid lily using molecular linkage maps［J］. Theor Appl Genet，2002，105:1175 －1182.

［5］ Nakatsuka A，Izumi Y，Yamagishi M. Spatial and temporal expression of chalcone synthase and dihydroflvonol 4-Reductase genes in Asiatic hybrid lily［J］. Plant Science，2003，165:759 －767.

［6］ Nakano M，Nakatsuka A，Nakayama M，et al. Mapping of quantitative trait loci for carotenoid pigmentation in flower tepals of Asiatic hybrid lily［J］. Scientia Horticulturae，2005，104:57 －64.

［7］ Yamagishi M. Oriental hybrid lily Sorbonne homologue of Lh-MYB12 regulates anthocyanin biosyntheses in flower tepals and tepal spots［J］. Mol breeding，2010，28:381 －389.

［8］ 趙祥云，王樹棟，陳新霞，等. 百合［M］. 北京:中國農業(yè)出版社，2000:56 －60.

［9］ 安田齊. 花色的生理生物化學［M］. 北京:中國林業(yè)出版社，1989:15 －54.

［10］ 趙昶靈，郭維明，陳俊愉.梅花花色色素種類和含量的初步研究［J］.北京林業(yè)大學學報，2004，26(2):68 －73.

［11］ 白新祥，胡可，戴思蘭，等. 不同花色菊花品種色素成分的分析［J］.北京林業(yè)大學學報，2006，28(5):84 －89.

［12］ 馬卡姆K R.黃酮類化合物結構鑒定技術［M］.北京:科學出版社，1990:42 －45.

［13］ 張培成. 黃酮化學［M］. 北京:化學工業(yè)出版社，2009:228 －230.

［14］ 張劍亮，何琴，潘大仁，等. 觀賞向日葵花瓣色素成分分析［J］.廣東農業(yè)科學，2011(8):125 －129.

［15］ 趙昶靈.幾個梅花品種花色的時空變化、花色苷的分子結構和F3’H 克隆的研究［D］.南京:南京農業(yè)大學，2005.

［16］ 張圓圓，齊冬梅，劉輝，等. 觀賞向日葵的花色多樣性及其與花青苷的關系［J］.園藝學報，2008，35(6):863 －868.

［17］ 張潔，王亮生，高錦明，等. 貼梗海棠花青苷組成及其與花色的關系［J］.園藝學報，2011，38(3):527 －534.