垂絲海棠、楸子扦插生根的生理機(jī)制1)

許曉崗 丁芳芳 童麗麗

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037) (金陵科技學(xué)院)

海棠是薔薇科蘋(píng)果屬優(yōu)良的觀花及觀果的園林植物，其苗木需求量逐年增加，如何快速繁殖已成為海棠苗木生產(chǎn)上急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。多年來(lái)，人們對(duì)海棠類植物的生根特性進(jìn)行了一些細(xì)胞學(xué)水平的研究，主要包括外源激素、扦插基質(zhì)、扦插季節(jié)等因素對(duì)扦插生根能力的影響以及扦插生根的解剖學(xué)過(guò)程等方面。但從生理學(xué)基礎(chǔ)上對(duì)海棠進(jìn)行蛋白質(zhì)組分及含量變化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。影響植物扦插生根的因子很多，除了外部環(huán)境因子以外，插穗本身的生理狀況也是重要的影響因子［1］。付紅祥［2］觀察到海棠的遺傳性狀和其插穗本身的生活能力對(duì)愈傷組織和根原始體的形成至關(guān)重要。細(xì)弱枝條制成的插穗生根量少、生根率低［3］。筆者對(duì)垂絲海棠(Malus halliana)和楸子(Malus prunifolia)的預(yù)扦插試驗(yàn)表明，不同種類、不同插穗類型、不同扦插時(shí)間、不同芽位的插穗都會(huì)對(duì)其生根產(chǎn)生很大影響。本研究在此基礎(chǔ)上，測(cè)定了2 種不同生根類型的海棠(楸子為皮部生根型，垂絲海棠為愈傷組織生根型)生根過(guò)程中的含水量、單寧、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶活性含量的變化，通過(guò)分析比較各指標(biāo)在生根過(guò)程中的變化揭示其對(duì)生根的影響，為揭示海棠的苗木扦插繁殖機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

垂絲海棠、楸子實(shí)生苗來(lái)源于南京六合馬集試驗(yàn)基地。插穗為9 ～10年生實(shí)生苗的當(dāng)年生枝條、生長(zhǎng)枝、結(jié)果枝，其中，當(dāng)年枝為一年生枝的統(tǒng)稱，生長(zhǎng)枝均為海棠的長(zhǎng)枝，即:不開(kāi)花結(jié)果的枝條。試驗(yàn)采用枝插，為觀測(cè)不同時(shí)期插穗內(nèi)部的生理變化，采條扦插時(shí)間分別為2010年9月3日、2011年3月23日、2011年4月15日、2011年6月3日。插穗采后迅速包裝好帶至插床進(jìn)行處理后扦插。插穗均采用500 mg/L 的IBA+NAA 水溶液(2 種激素各占一半)處理60 min。每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)插穗數(shù)量為300 ～600 枝。

1.2 試驗(yàn)方法

為了研究同一插穗類型的不同芽位生根率是否存在規(guī)律性，通過(guò)對(duì)2 種海棠不同芽位插穗的生理因子測(cè)定來(lái)找出其中的變化。選取當(dāng)年生生長(zhǎng)枝上自頂芽開(kāi)始由上往下逐個(gè)芽截取、制成長(zhǎng)3 ～5 cm的插穗。由于插穗相對(duì)較短，水分和養(yǎng)分含量相對(duì)較少。為防止水分和養(yǎng)分散失，除頂芽外，每個(gè)插穗頂部切口處均用石蠟封閉?？紤]到扦插的需要，舍棄節(jié)間過(guò)短的插穗。其他部分扦插試驗(yàn)按常規(guī)操作步驟進(jìn)行。

1.2.1 含水量測(cè)定

含水量采用阿貝折射儀測(cè)定。稱取鮮樣2 g 至1 號(hào)稱量瓶中，于105 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。計(jì)算組織水含量;稱取鮮樣2 g 至2 號(hào)稱量瓶中，加5 mL 65% ～70%的蔗糖溶液，稱質(zhì)量，放置4 ～6 h(其中輕搖數(shù)次)，用折射儀測(cè)定糖液濃度。組織水含量=(鮮質(zhì)量－干質(zhì)量)/鮮質(zhì)量×100%。自由水含量=糖液濃度×(糖液原濃度－浸后糖液濃度)/(浸后糖液濃度×鮮質(zhì)量)×100%。

1.2.2 單寧質(zhì)量濃度測(cè)定

單寧采用六氰合鐵(Ⅲ)酸亞鐵鉀吸光光度法測(cè)定。①工作曲線的繪制。吸取10.00 mg/L 的單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于50 mL 容量瓶中，加1 mL 0. 1 mol/L 的FeCl3，加1 mL 0.008 mol/L K3Fe(CN)6，用蒸餾水定容，搖均，放置30 min，于波長(zhǎng)760 nm 處分別用XG－721 型分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，空白試劑作參比。以單寧濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。②待測(cè)試液的制備。稱取剪碎的樣品1.00 g 于250 mL 錐形瓶中，加蒸餾水60 mL，在90℃水浴中浸提1.5 ～2.0 h，將上清液趁熱過(guò)濾入250 mL 容量瓶中，用熱蒸餾水洗滌試樣3 次(每次加水約30 mL)，每次洗滌液均濾入容量瓶中，冷卻至室溫，定容，搖勻，備用。③測(cè)定:吸取待測(cè)液1.00 mL 于50 mL 容量瓶中，加20 mL 蒸餾水，1 mL 0.1 mol/L 的FeCl3，待5 min 后，加1 mL 0.008 mol/L 的K3Fe(CN)6，用蒸餾水定容，搖勻，放置30 min后，于波長(zhǎng)760 nm 測(cè)定吸光度。從工作曲線上查出比色液質(zhì)量濃度(mg/L)，單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)=比色液?jiǎn)螌庂|(zhì)量濃度× 樣品質(zhì)量×10－4。樣品稀釋倍數(shù)為1.25 ×104。

1.2.3 可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

可溶性糖采用蒽酮比色法測(cè)定。①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確吸取0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別放入7 個(gè)100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，即成0、25、50、75、100、125、150 mg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)液。另取7 個(gè)50 mL 容量瓶分別放入蒽酮試劑10 mL，然后小心加入1 mL 標(biāo)準(zhǔn)液，充分搖勻，放入沸水浴中加熱10 min，取出后，在水中冷卻20 min。在610 nm 下測(cè)定光密度。以光密度為橫坐標(biāo)，糖液濃度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。②待測(cè)試液的制備。稱取鮮樣0.3 g，加少量乙醚，磨至漿糊狀，用40 mL 70 ℃蒸餾水洗滌轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，70 ℃水浴中保溫30 min，冷卻，加1 mL 醋酸鋅，1 mL 亞鐵氰化鉀，振蕩，定容，過(guò)濾至燒杯中，得到糖液。③測(cè)定。移取糖液1.00 mL 于干燥試管中，加入5 mL 蒽酮，混勻，于沸水浴中置10 min，冷卻，于620 nm 測(cè)定吸光度?？扇苄蕴?(0.179 9 +133.57 ×OD620)×10－4/w×100%(w 為樣品質(zhì)量)。

可溶性蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定?？捡R斯亮蘭G250染色后，595 nm 測(cè)定其吸光度。取酶提液0.2 mL，加入3 mL 考馬斯亮蘭，于595 nm 波長(zhǎng)測(cè)定OD 值。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及測(cè)定計(jì)算方法參照李合生［5］184－185。

1.2.4 多酚氧化酶及過(guò)氧化物酶活性測(cè)定

多酚氧化酶活性測(cè)定和計(jì)算方法參照蔣德安［4］。配制酶的反應(yīng)體系包括3.9 mL pH =5.5 的磷酸緩沖液、1 mL 0.1 mol/L 的兒茶酚溶液和0.1 mL 酶液，以煮過(guò)失活的酶液為對(duì)照，做二組重復(fù)試驗(yàn)。反應(yīng)體系加入酶液后，于37 ℃保溫10 min，迅速放入冰浴中，立即加入2 mL 的20%三氯乙酸，分別于520、470 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

過(guò)氧化物酶測(cè)定方法參照李合生［5］164－165。在比色杯中加入3 mL 反應(yīng)混合液(每28 μL 愈創(chuàng)木酚溶解于50 mL 0.1 mol/L pH6.0 的磷酸緩沖液，再加入19 μL 30% H2O2混合均勻)，再加入0.2 mL 粗酶液，對(duì)照以磷酸緩沖液代之，立即開(kāi)啟秒表，記錄470 nm 下的吸光度，重復(fù)3 次。POD 活性以每克鮮質(zhì)量材料每分鐘內(nèi)A470變化0.01 為1 個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.5 蛋白類(粗酶液)的制備

稱取1.0 g 材料放入研缽中，加8.0 mL 預(yù)冷的提取緩沖液，在0 ～4 ℃低溫下研磨，勻漿液經(jīng)15 000r/ min 冷凍離心20 min，上清液用于蛋白質(zhì)及多酚氧化酶活性的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 海棠不同插穗類型生根的生理因子變化

為觀測(cè)海棠不同插穗內(nèi)部生理因子與生根的關(guān)系，分別于2011年3月23日，4月3日和4月15日采條進(jìn)行扦插試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同海棠插穗對(duì)海棠扦插生根率有極顯著地影響。當(dāng)年枝生根率最高，生長(zhǎng)枝次之，結(jié)果枝最差。

2.1.1 含水量比較

由表1可知，不同插穗類型的總含水量不同，其中生長(zhǎng)枝總含水量最高，平均為52.42%(垂絲海棠)、44.02%(楸子);其次為當(dāng)年枝，含水量為51.77%(垂絲海棠)、43.11%(楸子)，結(jié)果枝含水量與當(dāng)年枝接近，平均為52.35%(垂絲海棠)、43.09%(楸子)。然而，自由水含量卻以當(dāng)年枝最高，平均為30.05%(垂絲海棠)、25.60%(楸子);生長(zhǎng)枝最低，平均為19.29%(垂絲海棠)、16.00%(楸子)。束縛水含量變化正好與自由水含量變化相反。2 種海棠的插穗在不同時(shí)間扦插，其含水量變化趨勢(shì)不一致。當(dāng)年生枝隨著扦插時(shí)間的推移其含水量逐漸下降，而生長(zhǎng)枝中為先上升后下降，結(jié)果枝中則逐漸上升。自由水含量變化與總含水量變化趨勢(shì)一致，束縛水與總含水量變化相反。

表1 不同種類插穗總含水量、自由含水量和束縛水含量 %

2.1.2 可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

表2顯示，3 種插穗中，當(dāng)年枝中的可溶性糖含量最高，平均為7. 12% (垂絲海棠)、5. 97% (楸子)，其次為生長(zhǎng)枝，平均為4.97%(垂絲海棠)、4.11%(楸子)。結(jié)果枝的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，平均只有4.26%(垂絲海棠)、3.50%(楸子)。不同類型、不同時(shí)間扦插的插穗隨著扦插時(shí)間的延遲可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸下降，這可能是由于插穗條在扦插過(guò)程中需要大量能量消耗，而可溶性糖正是它主要的能量來(lái)源。

表2 不同種類插穗可溶性糖、單寧和生根率

2.1.3 單寧質(zhì)量濃度變化

單寧一直被認(rèn)為是影響扦插的主要因素。通過(guò)對(duì)單寧的測(cè)定(表2)，不同的插穗條，單寧質(zhì)量濃度基本接近。當(dāng)年枝單寧質(zhì)量濃度為1.110(垂絲海棠)、0.939 mg·L－1(楸子)，結(jié)果枝為1.760(垂絲海棠)、1.432 mg·L－1(楸子)，生長(zhǎng)枝為1.360(垂絲海棠)、1.145 mg·L－1(楸子)。從不同扦插時(shí)間上看，單寧質(zhì)量濃度總體是增加的。

2.1.4 多酚氧化酶(PPO)活性變化

不同類型插穗以當(dāng)年枝多酚氧化酶活性最高(表3)，垂絲海棠插穗中平均為0.013 0 U，楸子插穗中則為0.011 35 U;其次為結(jié)果枝平均為0.011 60 U(垂絲海棠)、0.009 53 U(楸子)，生長(zhǎng)枝最低平均為0.008 75 U(垂絲海棠)、0.007 39 U(楸子)，從不同扦插時(shí)間來(lái)看，當(dāng)年枝的多酚氧化酶活性都比較強(qiáng)，結(jié)果枝與生長(zhǎng)枝的多酚氧化酶活性皆下降，其中生長(zhǎng)枝的下降速度最快，至4月15日達(dá)到最低值。

表3 不同種類插穗多酚氧化酶活性和過(guò)氧化物酶活性

2.1.5 過(guò)氧化物酶(POD)活性變化

過(guò)氧化物酶的變化基本與多酚氧化酶相似。由表3中測(cè)得的平均值來(lái)看，結(jié)果枝的活性最高，其次為生長(zhǎng)枝，最低為當(dāng)年枝。從不同扦插時(shí)間看，過(guò)氧化物酶活性總趨勢(shì)是下降的，當(dāng)年枝下降不大，而生長(zhǎng)枝與結(jié)果枝下降速度較快，至4月15日它們分別下降到0.035 7(垂絲海棠)、0.029 1 U·g－1·min－1(楸子)和0.039 7(垂絲海棠)、0.032 2 U·g－1·min－1(楸子)。

2.1.6 5 種生理生化因子與海棠扦插生根率的相關(guān)性

由表4可知，當(dāng)年枝海棠扦插生根率與束縛水含量、多酚氧化酶活性達(dá)到顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為－0.86(垂絲海棠)、－0.85(楸子)，－0.83(垂絲海棠)、－0.80(楸子)。與總含水量、自由水含量達(dá)到顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.87(垂絲海棠)、0.84(楸子)，0.89(垂絲海棠)、0.85(楸子)。而與可溶性糖含量相關(guān)性不大。單寧含量與可溶性糖達(dá)到顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.996(垂絲海棠)、0.998(楸子);而與多酚氧化酶活性達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為－0. 87(垂絲海棠)、－0. 84(楸子)。多酚氧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性與可溶性糖含量達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為－0.89(垂絲海棠)、－0. 87(楸子)、－0. 94(垂絲海棠)、－0.90(楸子)。

表5顯示:結(jié)果枝扦插生根率與總含水量、自由水含量、多酚氧化酶達(dá)到極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.97(垂絲海棠)、0.98(楸子);0.91(垂絲海棠)、0.89(楸子);0.97(垂絲海棠)、0.99(楸子)。與束縛水含量、可溶性糖、單寧含量達(dá)到極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為－0.87(垂絲海棠)、－0.88(楸子);－0.93(垂絲海棠)、－0.99(楸子);－0.94(垂絲海棠)、－0.94(楸子)，而與過(guò)氧化物酶沒(méi)有多大相關(guān)性。單寧含量與束縛水含量、可溶性糖極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97(垂絲海棠)、0.99(楸子);0.95(垂絲海棠)、0.94(楸子)。與過(guò)氧化物酶顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.96(垂絲海棠)、0.84(楸子)，與多酚氧化酶極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.96(垂絲海棠)、－0.97(楸子)。

可見(jiàn)，無(wú)論是當(dāng)年生枝還是結(jié)果枝，影響扦插最大的因子是含水量。一般說(shuō)來(lái)，插穗內(nèi)總含水量和自由水含量越高，插穗越容易生根，扦插也容易成活。可溶性糖是有效的碳源和能量來(lái)源，適量的碳源有利于促進(jìn)植物插穗不定根的大量產(chǎn)生，中等濃度的蔗糖對(duì)垂絲海棠愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖、生長(zhǎng)最有利。但當(dāng)年生枝的分析表明可溶性糖對(duì)扦插生根沒(méi)有多大的相關(guān)性，結(jié)果枝卻表明可溶性糖越高、生根率越低。這可能是由于可溶性糖在降解過(guò)程中形成大量的酚類物質(zhì)對(duì)扦插產(chǎn)生不利影響。因此，提高插穗中自由水含量，提高插穗生理活性對(duì)增強(qiáng)多酚氧化酶的活性、降低細(xì)胞中單寧的質(zhì)量濃度是有利于提高扦插生根率的。

表4 當(dāng)年生枝若干生理生化因子與扦插生根率的相關(guān)系數(shù)

表5 結(jié)果枝若干生理生化因子與扦插生根率的相關(guān)系數(shù)

2.2 海棠生長(zhǎng)枝插穗不同芽位的三個(gè)時(shí)間段采條的生理變化

2.2.1 含水量變化

由表6可知，頂芽和1 ～3 節(jié)側(cè)芽的總含水量都有不同程度的下降，并表現(xiàn)出越幼嫩的芽失水越嚴(yán)重［6］。4 ～7 節(jié)側(cè)芽則木質(zhì)化程度較高，總含水量基本沒(méi)有變化。不同時(shí)間采集的插穗其總含水量都是在3月23日的最低，但整個(gè)趨勢(shì)變化不大，范圍均在44% ～52% (表6)。而自由水含量差異顯著。頂芽與1 節(jié)側(cè)芽始終保持較高的自由水含量，而2 ～5節(jié)側(cè)芽在3月23日下降迅速，6 ～7 節(jié)則不斷上升。由于插穗中大量可用的插穗芽位是2 ～5 節(jié)側(cè)芽，因此冬天或早春采集的插穗不利于扦插生根。3月份后，氣溫回暖，海棠插穗細(xì)胞新陳代謝開(kāi)始加強(qiáng)。6月3日采集的插穗，其不同芽位的自由水含量顯著高于9月3日和3月23日采集的相應(yīng)插穗的自由水含量。同一插穗不同芽位由頂芽到第7 節(jié)側(cè)芽其總含水量逐漸下降，其中9月3日采集的插穗總含水量下降了12.57%(垂絲海棠)、12.56%(楸子)。3月23日采集的插穗下降了9.84%(垂絲海棠)、9.85%(楸子)。而6月3日采集的插穗只下降了5.30%(垂絲海棠)、5.94%(楸子)(表6)。表明6月3日采集的插穗總含水量在不同芽位分布相對(duì)較均一，扦插采穗利用率較高。

2.2.2 可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

不同時(shí)間采集的插穗自頂芽由上而下可溶性糖含量逐漸下降，3 種不同時(shí)間采集于4 ～7 節(jié)芽位的插穗可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)以3月23日采集的海棠插穗為最高，主要由于冬季插穗細(xì)胞內(nèi)含有大量的淀粉質(zhì)體，貯藏了大量的淀粉，隨著時(shí)間推移和春季的到來(lái)，插穗新陳代謝的加強(qiáng)，大量的淀粉被降解為可溶性糖，給側(cè)芽的萌動(dòng)所需(表6)。

2.2.3 可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

3 種不同時(shí)間采集的插穗可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差較大，與可溶性糖變化一致。其中以9月3日可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較低，平均為1.638%(垂絲海棠)、1.065%(楸子)，6月3日可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，平均為2.679%(垂絲海棠)、1.741%(楸子)。不同時(shí)間采集的插穗自頂芽由上而下可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸下降，表明同一時(shí)間采集的插穗及插穗不同芽位新陳代謝活性不一致［7］(表6)。

2.2.4 單寧質(zhì)量濃度變化

海棠扦插生根率低，一般認(rèn)為是單寧含量較高，愈傷組織難以形成［8］。由表6可知:3 種不同時(shí)間采集的插穗條中，以6月3日采集的插穗單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。同一采穗條中，頂芽單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，第一節(jié)側(cè)芽至第七節(jié)側(cè)芽變化不大。隨著春季溫度上升和芽的萌動(dòng)［9］，海棠插穗條中單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少。插穗中單寧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化范圍為1. 81 ～3.03 mg·L－1，表明單寧不是影響扦插生根的主要因子。

2.2.5 多酚氧化酶活性變化

不同時(shí)間采集的插穗以頂芽多酚氧化酶活性最大，平均為0.074 9 U(垂絲海棠)和0.061 6 U(楸子)。然后下降，至第七節(jié)側(cè)芽達(dá)到最低，平均為0.033 7 U(垂絲海棠)和0.027 5 U(楸子)。從不同采穗時(shí)間來(lái)看，6月3日采集的插穗多酚氧化酶活性比其它時(shí)間采集的插穗都強(qiáng)，這與蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化一致(見(jiàn)表6)。

表6 生長(zhǎng)枝不同芽位的生理因子變化

2.3 兩種海棠生長(zhǎng)枝生根過(guò)程中插穗內(nèi)部的生理變化

2.3.1 含水量變化

3月23日扦插的插穗其含水量，垂絲海棠在第9 天達(dá)到最低(楸子在第5 天)，此后穩(wěn)步緩慢上升。(表7)這一結(jié)果與海棠扦插的解剖構(gòu)造變化相一致［10］。9d 后愈傷組織形成，楸子的皮部突起增加，意味著插穗具備微弱吸水能力的開(kāi)始，使得含水量逐漸上升。4月15日扦插的插穗其含水量在5d(楸子在第9 天)達(dá)到峰值，此后逐漸下降到第11 天(楸子在第30 天)達(dá)到最低，然后再逐漸上升。這可能是由于4月15日扦插的插穗由于氣溫已經(jīng)上升，新陳代謝旺盛，水分流動(dòng)性加強(qiáng)的原因［11］。

2.3.2 可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

兩種海棠插穗中的可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，隨著時(shí)間推移，顯現(xiàn)先上升后下降的過(guò)程(見(jiàn)表8)。3月23日扦插的插穗其蛋白質(zhì)，在2 種海棠的插穗中扦插后第15 天達(dá)到高峰。而4月15日扦插的垂絲海棠插穗可溶性質(zhì)蛋白質(zhì)比3月23日扦插的插穗提早近10 d(楸子提早6 d)達(dá)到峰值，有利于插穗切口愈合生根［12］。

表7 海棠生長(zhǎng)枝生根過(guò)程中插穗內(nèi)部含水量變化 %

表8 海棠生長(zhǎng)枝生根過(guò)程中插穗內(nèi)部的可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

2.3.3 單寧質(zhì)量濃度變化

插穗中的單寧質(zhì)量濃度隨著扦插后天數(shù)的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(表9)，4月15日扦插的插穗條其單寧質(zhì)量濃度平均值分別為4.05(垂絲海棠)、3.64 mg·L－1(楸子)，高于3月23日扦插的插穗中的含量，分別為3.75(垂絲海棠)、3.27 mg·L－1(楸子)。由于多酚氧化酶活性上升的幅度(表10)高于單寧上升的速度，表明4月15日扦插后因插穗水分充足，代謝旺盛，有利于消除單寧等酚類物質(zhì)的毒害。

表9 海棠生長(zhǎng)枝生根過(guò)程中插穗內(nèi)部的單寧質(zhì)量濃度 mg/L

2.3.4 多酚氧化酶活性變化

扦插后第5 天開(kāi)始，插穗中的多酚氧化酶活性隨著時(shí)間推移增加(表10)。4月15日扦插的插穗其多酚氧化酶活性，平均分別為0.088 95 U(垂絲海棠)和0.115 08 U(楸子);顯著大于3月23日扦插的插穗，平均分別為0.052 30 U(垂絲海棠)、0.072 85 U(楸子)，4月15日扦插的插穗分別上升了1.94 倍(垂絲海棠)、1.30 倍(楸子)，而3月23日扦插的插穗中多酚氧化酶活性分別上升了1.17 倍(垂絲海棠)、2.17 倍(楸子)?？磥?lái)楸子插穗中該酶活性啟動(dòng)得較早，這與其耐寒性的分布有關(guān)［13］。

表10 海棠生長(zhǎng)枝生根過(guò)程中插穗內(nèi)部的多酚氧化酶活性 U

3 結(jié)論與討論

扦插繁殖從插穗選擇到植株形成，包括切口愈傷組織形成、根原始體產(chǎn)生、貫穿插穗徑向的維管束橋的形成等。在這一過(guò)程中，插穗內(nèi)部發(fā)生了許多生理變化，插穗的生活能力對(duì)愈傷組織及根原始體的形成至關(guān)重要。試驗(yàn)表明:不僅不同插穗類型的生根率不同，同一插穗類型的不同采集時(shí)間因木質(zhì)化程度的差異其扦插生根率也不同，而且同一插穗不同芽位的扦插生根率也不同。這主要由復(fù)雜的內(nèi)部與外部環(huán)境所影響的［14］。在內(nèi)部生理生化因子中，含水量、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、單寧質(zhì)量濃度、多酚氧化酶活性及激素等，都會(huì)因不同插穗類型、同一類型不同采條時(shí)間、不同扦插時(shí)間而在扦插生根過(guò)程中產(chǎn)生不同的影響。

當(dāng)年生枝相應(yīng)的生理生化因子，如自由水含量、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)等都較其它2 種類型的插穗要高，而單寧質(zhì)量濃度較其它2 種類型插穗條要低，故扦插生根率高于其它2 種插穗(表2)。無(wú)論是哪一種海棠，當(dāng)年生插穗的自由水含量均較高，束縛水含量較低，多酚氧化酶活性及過(guò)氧化物酶活性較高，植物體內(nèi)的新陳代謝旺盛，同時(shí)自我保護(hù)能力也加強(qiáng)，清除酚類物質(zhì)在植物體內(nèi)的毒害［15］，從而有利于愈傷組織的形成，導(dǎo)致扦插生根率較高。因此，一般地說(shuō)自由水含量對(duì)植物體扦插起到關(guān)鍵的作用。自由水是植物體內(nèi)新陳代謝物質(zhì)的運(yùn)輸主體，自由水含量越高，細(xì)胞滲透活動(dòng)越活躍，越有利于細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)和繁殖，促進(jìn)不定根的形成。同時(shí)，自由水含量高可降低單寧的含量，增強(qiáng)多酚氧化酶等活性，可提高扦插生根率。但不同芽位的自由水含量以頂芽為最高，而生根率最低。在扦插過(guò)程中，含水量對(duì)植物的扦插生根確實(shí)十分重要。因此，可能的解釋為:植物采條制穗時(shí)，插穗的木質(zhì)化程度對(duì)扦插的生根十分重要，越幼嫩的部位越易失水［16］，從而影響了扦插的生根率。由此可見(jiàn)，對(duì)于海棠這類扦插生根較難的樹(shù)種，插穗的來(lái)源選擇尤為重要。僅靠外部噴霧并不能有效增加插穗內(nèi)的含水量，除選擇合適的枝條外，扦插季節(jié)也很重要。

有學(xué)者認(rèn)為溫度和濕度的適宜與否是海棠扦插生根的主要因子［17］。溫度過(guò)高，濕度過(guò)低，插穗易失水干枯，溫度過(guò)低，傷口愈合速度緩慢。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，3月23日扦插時(shí)，插穗還未完全萌動(dòng)，生理活性較低，地溫未上升使根系供水能力差［18］。扦插后隨著溫度的上升，插穗的含水量緩慢上升(表7)，而可溶性蛋白質(zhì)含量(表8)、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及多酚氧化酶活性(表10)等都還較低［19］。這時(shí)，插穗缺乏水分的供應(yīng)，代謝較弱，又因外界環(huán)境干燥，新發(fā)出的芽易失水，故自由水含量較低。扦插后初期的7 d 內(nèi)在切口附近的各種生活的薄壁細(xì)胞還未脫分化形成愈傷組織。此時(shí)扦插的插穗最易因外界環(huán)境的不適而死亡，因此必須加強(qiáng)養(yǎng)護(hù)管理。7 d后，插穗切口形成的愈傷組織細(xì)胞，具備了保護(hù)和防止水分散失的功能，并且代替了根的部分吸水功能。這樣可以緩慢而不斷地向插穗輸送少量水分，插穗中的含水量逐漸升高(表7)，可溶性蛋白質(zhì)(表8)、可溶性糖含量及多酚氧化酶活性(表10)等緩慢上升。而4月15日扦插時(shí)插穗已經(jīng)完全萌動(dòng)，新陳代謝旺盛，水分、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及多酚氧化酶等都處于較高的代謝水平，導(dǎo)致扦插后出現(xiàn)含水量，及其它生理生化因子的下降。插穗由于扦插后溫度較高，代謝加快，因此，扦插后5 d，插穗的含水量、蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量等就顯著升高。而后，由于插穗得不到切口基部的水分供應(yīng)，自由水含量不斷下降，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)等也因消耗下降。到第11 天，插穗切口開(kāi)始略有保水和吸水能力后，水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸和代謝由此開(kāi)始了。插穗中的含水量、可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量及多酚氧化酶等又逐漸升高。而扦插后，單寧質(zhì)量濃度增加(表9)，與多酚氧化酶活性增加同步進(jìn)行，單寧對(duì)植物扦插是有影響的，但海棠插穗中單寧平均僅為1.81 ～3.03 mg·L－1，對(duì)細(xì)胞活動(dòng)影響不大。因此，可能不是影響扦插生根的主要因子。

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