響應(yīng)曲面法優(yōu)化纖維素酶酶解提取工藝

石亞中，方嬌龍，錢時權(quán)，伍亞華，李善菊，許 暉

(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化纖維素酶酶解提取工藝

石亞中，方嬌龍，錢時權(quán)，伍亞華，李善菊，許 暉

(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

為優(yōu)化纖維素酶酶解提取白藜蘆醇工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗，選擇酶添加量、酶解時間和酶解溫度為自變量，以白藜蘆醇含量為響應(yīng)值。結(jié)果表明：3個因素對白藜蘆醇提取效果影響的主次順序依次為酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度，酶添加量為極顯著影響因素，酶解時間和酶解溫度影響不顯著。確定纖維素酶酶解處理山葡萄渣白藜蘆醇提取工藝的最佳條件為酶添加量1.30mg/g、酶解時間1.48h、酶解溫度55.49℃，在此條件下提取得到的白藜蘆醇含量為0.746mg/g，是優(yōu)化前提取得到的白藜蘆醇含量的1.15倍。

白藜蘆醇；纖維素酶酶解；響應(yīng)曲面分析法

白藜蘆醇(Resveratro1)是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，1940 年由日本人首次從毛葉藜蘆(Veratrum grandifl orum O. Loes)的根中獲得[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗癌、抗菌、抗氧化、心血管保護等多方面的生物藥理作用[3-13]。葡萄中含有豐富的白藜蘆醇，尤以葡萄皮和葡萄籽中含量最多[14-15]。

目前白藜蘆醇的提取方法主要有有機溶劑法、熱水浸提法、超聲波法、超臨界萃取法、酶法等。其中，酶法提取應(yīng)用較多的是纖維素酶，纖維素酶是一組復(fù)合酶，大部分植物的細(xì)胞壁由纖維素構(gòu)成，植物的有效成分往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，纖維素酶能夠水解纖維素，使植物細(xì)胞壁破壞，充分釋放細(xì)胞內(nèi)含物，有利于對有效成分的提取，進(jìn)而提高物料的利用率[16-19]。本研究采用Box-Behnken試驗優(yōu)化纖維素酶酶解提取山葡萄渣白藜蘆醇工藝，為進(jìn)一步開發(fā)利用山葡萄渣白藜蘆醇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山葡萄購自蚌埠市農(nóng)貿(mào)市場，除去果肉后得到葡萄皮和葡萄籽混合物，經(jīng)干燥后過60目篩。

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%) 山東泓捷生物科技有限公司；纖維素酶(酶活力為40000U/g) 杰諾生物酶有限公司；無水乙醇、甲醇、丙酮均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752N紫外分光光度計、FA-N/FC電子分析天平、GL-12B高速冷凍離心機 上海精密科學(xué)儀器有限公司；B220型恒溫水浴鍋、RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FW80型高速萬能粉碎機 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 白藜蘆醇的提取[20]

準(zhǔn)確稱取山葡萄渣粉末1.0g，放入150mL錐形瓶中，加入適量水和纖維素酶進(jìn)行酶解，酶解后加入一定量的體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液和80%的丙酮溶液(體積比1:1)，提取一段時間后，將提取液離心，上清液經(jīng)濃縮、蒸發(fā)得白藜蘆醇樣品。

1.3.2 白藜蘆醇含量的測定[21]

稱取適量白藜蘆醇置于容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得白藜蘆醇對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于波長306nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對照品白藜蘆醇含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸線性方程y=0.6942x-0.0315，R2=0.9942，線性范圍為0.3～1.59mg/g。由線性回歸方程可知，白藜蘆醇含量與吸光度值呈正相關(guān)。準(zhǔn)確稱取一定量樣品于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樣品液，于波長306nm處測定吸光度，由線性回歸方程得出白藜蘆醇的含量。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 酶添加量對白藜蘆醇提取效果的影響

取適量粉末，分別添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/g的纖維素酶，在55℃、pH5條件下，酶解1.5h。酶解后加入一定量的乙醇溶液，提取一段時間后，將提取液離心，經(jīng)濃縮、蒸發(fā)得白藜蘆醇樣品。用甲醇溶液溶解樣品并稀釋，搖勻，于波長306nm處測定吸光度。每個實驗重復(fù)3次，考察酶添加量對白藜蘆醇提取效果的影響。

1.3.3.2 酶解pH值對白藜蘆醇提取效果的影響

在酶添加量1.5mg/g、55℃條件下，pH3.5～6.0范圍內(nèi)，酶解1.5h，考察pH值對白藜蘆醇提取效果的影響。1.3.3.3 酶解時間對白藜蘆醇提取效果的影響

在酶添加1.5mg/g、55℃、pH5條件下，酶解0.5～3h，考察酶解時間對白藜蘆醇提取效果的影響。1.3.3.4 酶解溫度對白藜蘆醇提取效果的影響

在酶添加1.5mg/g、pH5條件下，40～65℃酶解1.5h，考察溫度對白藜蘆醇提取效果的影響。

1.3.4 Box-Behnken試驗設(shè)計

采用Box-Behnken設(shè)計，選取酶添加量、酶解時間和酶解溫度為自變量，以白藜蘆醇含量Y為響應(yīng)值，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶添加量對白藜蘆醇提取效果的影響

由圖1可知，在酶添加量為0.5～1.5mg/g時，隨著酶添加量的增加，白藜蘆醇含量隨酶添加量增加逐漸增大；當(dāng)酶添加量為1.5mg/g時，白藜蘆醇含量達(dá)到最大；此后，繼續(xù)增加酶添加量，白藜蘆醇含量反而有下降的趨勢。根據(jù)分子絡(luò)合學(xué)說，由于底物與酶分子反應(yīng)過程中，存在某個平衡點，當(dāng)酶量較低時，酶分子與底物可以充分結(jié)合；當(dāng)繼續(xù)增加酶量，底物結(jié)合酶的程度會加大，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到飽和后，酶活性趨于穩(wěn)定。因此，并不是酶量越大越利于酶解效果的發(fā)揮，對于一定的底物來說，存在一個最佳的酶用量。

圖1 酶添加量對白藜蘆醇提取效果的影響Fig.1 Effect of enzyme/substrate ratio on resveratrol yield

2.1.2 酶解pH值對白藜蘆醇提取效果的影響

圖2 酶解pH值對白藜蘆醇提取效果的影響Fig.2 Effect of hydrolysis pH on resveratrol yield

由圖2可知，隨著pH值的增大，白藜蘆醇的含量先呈增加的趨勢；當(dāng)pH值達(dá)到5時，白藜蘆醇含量達(dá)到最大；此后，隨著pH值的增大，白藜蘆醇含量下降。因此確定酶解較佳pH值為5。

2.1.3 酶解時間對白藜蘆醇提取效果的影響

由圖3可知，反應(yīng)開始時，隨著酶解時間的延長，白藜蘆醇的含量逐漸增大；當(dāng)酶解1.5h后，再延長酶解時間，白藜蘆醇含量逐漸減小。原因很可能是由于酶與底物的充分反應(yīng)需要一定的時間，時間很短時，酶分子與底物結(jié)合程度較低，酶解效果不理想，隨著反應(yīng)時間的延長，酶與底物充分結(jié)合，此時，酶解效果最佳。如果再延長反應(yīng)時間，酶解產(chǎn)物白藜蘆醇的量會慢慢增加，加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行，酶反應(yīng)速率會有所下降，從而導(dǎo)致提取效率下降。因此，確定較適宜酶解時間為1.5h。

圖3 酶解時間對白藜蘆醇提取效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on resveratrol yield

2.1.4 酶解溫度對白藜蘆醇提取效果的影響

圖4 酶解溫度對白藜蘆醇提取效果的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on resveratrol yield

由圖4可知，在酶解溫度為40～55℃時，白藜蘆醇含量隨酶解溫度升高逐漸增加，酶解溫度在55℃時白藜蘆醇的含量最高；55℃以后，隨著酶解溫度升高，白藜蘆醇含量增加不明顯。這是由于在酶解反應(yīng)中，溫度與酶穩(wěn)定性及反應(yīng)速率有關(guān)。當(dāng)溫度升高時，反應(yīng)速率加快，這樣就利于酶解的進(jìn)行，而當(dāng)溫度過高時，可能會使部分或全部酶分子產(chǎn)生變性甚至失活，導(dǎo)致酶分子與底物結(jié)合效率下降，使反應(yīng)速率降低。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酶添加量(X1)、酶解時間(X2)和酶解溫度(X3)為自變量，以白藜蘆醇含量(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗設(shè)計及結(jié)果如表1所示。采用SAS軟件進(jìn)行回歸分析，得到二次方程模型為：

由表2可知，模型顯著(P＜0.0001)，并且失擬項不顯著(P＝0.063866＞0.05)，R2＝0.9988表明此模型能解釋99.88%響應(yīng)變化，回歸方程擬合程度良好，因此此模型可以真實地擬合和預(yù)測實際情況。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：一次項X1，二次項X12、X22和X32極顯著，X2和X3不顯著，交互項X1X2、X1X3和X2X3不顯著。因素X1、X2及X3的P值分別為0.0001、0.05412及0.229975，表明酶添加量影響極顯著，酶解時間和酶解溫度影響不顯著，3個因素對白藜蘆醇提取效果影響的主次順序依次為酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table1 Box-Behnken experimental design and results

表2 方差分析表Table2 Analysis of variance for the fitted regression model

2.3 各因素及交互作用對白藜蘆醇提取效果的影響

由圖5a可知，當(dāng)酶解溫度為55℃時，酶添加量一定，當(dāng)酶添加量較低時，白藜蘆醇含量隨酶解時間的增加得緩慢，當(dāng)酶添加量達(dá)到一定值時，隨酶解時間的延長，白藜蘆醇含量增加得較快，當(dāng)酶解時間繼續(xù)延長，白藜蘆醇含量緩慢降低。酶解時間一定，隨著酶添加量的增加，白藜蘆醇含量增加顯著，當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加白藜蘆醇含量反而會有所下降。分析圖5可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶添加量恒定在1.0～1.5mg/g范圍內(nèi)，酶解時間在1.4～1.6h范圍內(nèi)，白藜蘆醇含量逐漸增加并達(dá)到極大值。

由圖5b可知，酶添加量不變，隨著酶解溫度增加，白藜蘆醇含量先增加后減少。當(dāng)酶解溫度在52～58℃范圍時，白藜蘆醇含量較高。酶解溫度恒定，酶添加量在1.0～1.5mg/g范圍內(nèi)，白藜蘆醇含量先逐漸增加，達(dá)到極大值，隨后逐漸下降。

由圖5c可知，酶解時間不變，酶解溫度對白藜蘆醇含量影響的等高線較稀疏，總體呈先增后減的趨勢。酶解溫度恒定，酶解時間對白藜蘆醇含量影響的等高線較稠密，白藜蘆醇含量先逐漸增加，達(dá)到極大值后逐漸下降。白藜蘆醇含量極大值在酶解時間1.5～1.6h，酶解溫度54～58℃之間。

圖5 各兩因素交互作用對白藜蘆醇提取效果影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots showing the effects of hydrolysis conditions on resveratrol yield

2.4 纖維素酶酶解處理提取山葡萄渣白藜蘆醇最佳工藝參數(shù)的確定及模型驗證

根據(jù)回歸方程，經(jīng)SAS軟件分析，得出山葡萄渣白藜蘆醇提取最佳工藝參數(shù)為酶添加量1.30mg/g、酶解時間1.48h、酶解溫度55.49℃，得到白藜蘆醇含量為0.753mg/g。為驗證模型的可靠性，在該優(yōu)化條件下進(jìn)行3 組重復(fù)驗證實驗，驗證實驗得到的白藜蘆醇含量平均值為0.746mg/g，平均誤差為1.56%，小于5%，實驗值與理論值基本吻合，說明該模型真實可靠，能較好地預(yù)測山葡萄渣白藜蘆醇提取效果。與優(yōu)化前提取得到的白藜蘆醇含量(0.648mg/g)相比，是優(yōu)化前提取得到的白藜蘆醇含量的1.15倍。

3 結(jié) 論

3.1 采用Box-Behnken試驗設(shè)計，建立白藜蘆醇含量與酶添加量、酶解時間和酶解溫度的二次多項式多元回歸模型。結(jié)合試驗，通過響應(yīng)面分析可知，酶添加量對白藜蘆醇提取效果影響最大，其次是酶解時間，酶解溫度則最小。

3.2 得到纖維素酶酶解處理提取山葡萄渣白藜蘆醇的最佳工藝參數(shù)為酶添加量1.30mg/g、酶解時間1.48h、酶解溫度55.49℃，在此優(yōu)化條件下，經(jīng)驗證實驗，白藜蘆醇含量為0.746mg/g，平均誤差為1.56%，小于5%，實驗值與理論值基本吻合，說明該模型真實可靠。與優(yōu)化前提取得到的白藜蘆醇含量(0.648mg/g)相比，是優(yōu)化前提取得到的白藜蘆醇含量的1.15倍。這說明Box-Behnken試驗設(shè)計能充分發(fā)揮纖維素酶酶解作用，有效提高山葡萄渣白藜蘆醇提取效率。

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Response Surface Methodology for the Optimization of Enzymatic Extraction of Resveratrol Grape Pomace with Cellulase

SHI Ya-zhong，F(xiàn)ANG Jiao-long，QIAN Shi-quan，WU Ya-hua，LI Shan-ju，XU Hui
(Department of Bioengineering and Food, Bengbu College, Bengbu 233030, China)

The extraction of resveratrol from grape pomace by cellulase hydrolysis was optimized using response surface methodology. The extraction yield of resveratrol was extremely significantly influenced by enzyme dosage but not significantly impacted by time or temperature. The optimum conditions for enzymatic extraction of resveratrol from grape pomace were found to be hydrolysis at 55.49 ℃ for 1.48 h with an enzyme/substrate ratio of 1.30 mg/g. The extraction yield of resveratrol under these conditions was 0.746 mg/g, which was 1.15-fold higher than before optimization.

resveratrol；cellulase hydrolysis；response surface methodology

TS255；S663

A

1002-6630(2013)04-0075-05

2011-11-16

安徽省高等學(xué)校省級食品科學(xué)與工程特色專業(yè)建設(shè)點項目(20101091)；安徽省食品科學(xué)與工程教學(xué)團隊項目(20101094)；蚌埠學(xué)院自然科學(xué)研究項目(2010ZR14)；蚌埠學(xué)院優(yōu)秀人才資助項目(院字[2009]107號)

石亞中(1979—)，男，講師，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：stoney2008@yahoo.cn