人參皂苷Rbl對(duì)大鼠腦缺血再灌注JAK2／STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響＊

余 錄，胡光強(qiáng)，陳碧瓊，涂 華，楊朝鮮

（瀘州醫(yī)學(xué)院：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.神經(jīng)生物研究室，四川瀘州646000）

腦卒中為目前世界上致死率和致殘率排名第2位的疾病［1］，缺血性腦卒中占卒中病例的70%～80%，是腦卒中的主要類型，嚴(yán)重威脅人類健康與生命安全。因此，開發(fā)安全、有效的治療藥物、尋找確切的治療靶點(diǎn)已是當(dāng)前迫切需要。人參是中國(guó)傳統(tǒng)中藥之精品，人參皂苷（ginsenoside，GR）是人參的主要有效成分，在臨床上尤其是神經(jīng)科得到廣泛的應(yīng)用。GR按苷元的不同分多種類型，其中，GRbl含量最為豐富。研究表明，GRbl能通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等保護(hù)腦缺血再灌注損傷。Janus激酶／信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinases／signal transducers and activators of transcription，JAKs／STATs）是細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激的一條重要的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程密切相關(guān)［2］。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（MCAO／R）模型，探討GRbl對(duì)JAK2／STAT 3胞內(nèi)信號(hào)通路的影響，明確其保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 GRbl（純度大于或等于98%，白色粉末，批號(hào)：ZL20100705A），由南京澤朗植提技術(shù)有限公司提供。磷酸化JAK2多克隆抗體，磷酸化STAT3單克隆抗體（Santa Cruz公司產(chǎn)品）。SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），TNF-α、IL-6ELISA試劑盒（北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、溶媒組、GRbl高劑量組（40mg／kg）、GRbl低劑量組（20mg／kg）。假手術(shù)組和溶媒組給予等量的生理鹽水，藥物和溶媒均在再灌時(shí)立即腹腔注射。

1.2 方法

1.2.1 MCAO／R模型的建立 大鼠用10%水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，從頸部正中切口，依次小心分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）及頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎并剪斷ECA，在ECA近分叉處用眼科手術(shù)剪剪一小口，從ECA往ICA插入制備好的栓線，栓線頭端圓潤(rùn)，直徑約0.34mm，插入深度為18～20mm，感到有阻力時(shí)停止插入，然后將栓線尾端固定于ECA上，逐層縫合肌肉皮膚。缺血2h后，將栓線頭端拉出實(shí)現(xiàn)再灌注。術(shù)中由紅外燈照射使大鼠體溫維持在37℃。假手術(shù)組除不插入線栓外，其余步驟相同。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 缺血后2h，參照Longa等［3］方法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分。0分：無任何神經(jīng)功能缺損；1分：右前肢不能完全伸展；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走或靜止時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：不能自主活動(dòng)；5分：死亡。在初次評(píng)分后滿足1～3分的大鼠納入后繼的實(shí)驗(yàn)組。再灌注后24h，再次對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.3 TNF-α、IL-6的含量測(cè)定 每組8只大鼠，再灌24h后，將大鼠麻醉，剖開胸腔，剪破右心耳，用生理鹽水從左心室灌流至流出液為澄清，取出大腦缺血側(cè)-80℃保存，測(cè)定前稱重，以1∶10比例加入冰生理鹽水勻漿，3 500r／min離心15min，取出上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)TNF-α、IL-6的含量。

1.2.4 p-JAK2和p-STAT3免疫組織化學(xué)的檢測(cè) 每組4只大鼠，再灌注24h后，先用冰凍的PBS溶液（pH為7.2～7.4）約200mL快速灌流，再用4%的多聚甲醛溶液灌流。然后迅速剪開顱骨，取出大腦，用10%中性甲醛固定24～48h，從大腦前囟-2.3mm處向后切取厚約3mm的冠狀腦組織，用石蠟包埋，制作厚度約5μm的腦部冠狀切片，用于免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)采用SABC法。將石蠟切片脫蠟、復(fù)水，3%的H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后用微波進(jìn)行抗原修復(fù)、5%BSA液封閉，清洗后加一抗（p-JAK2和p-STAT3），37℃孵育2h，移置于4℃冰箱過夜。加二抗孵育1h，清洗后滴加SABC，37℃孵育1h后，清洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化、氨水返藍(lán)、脫水封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 免疫組織化學(xué)染色后，取缺血側(cè)皮層額葉4個(gè)不重疊的區(qū)域采圖，然后用Image Pro-plus5.0軟件分析免疫組織化學(xué)陽(yáng)性表達(dá)的累積光密度值（IOD）并計(jì)算每組平均值。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析的方法進(jìn)行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GRbl對(duì)缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響 再灌24 h后，大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙，其主要表現(xiàn)為Horner綜合征即右側(cè)瞳孔縮小、眼瞼下垂、眼裂狹小甚至眼底出血呈紅腫，肢體障礙即提尾時(shí)左前肢內(nèi)收、肩內(nèi)旋、肌張力明顯降低，爬行時(shí)向右側(cè)劃圈、追尾，甚至傾倒或不能自行行走。與溶媒組比較，GRbl高劑量組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.05），GRbl低劑量組評(píng)分也有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 GRbl對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織中TNF-α和IL-6的影響 缺血2h再灌注24h后，溶媒組TNF-α、IL-6含量明顯增高。與溶媒組比較，GRbl低劑量組、高劑量組TNF-α含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），IL-6的含量也有所降低，其中，高劑組顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表1 GRbl對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響（±s，n＝12）

表1 GRbl對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響（±s，n＝12）

＊：P＜0.05，與溶媒組比較。

組別 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分假手術(shù)組0.00±0.00溶媒組 2.75±0.96 GRbl低劑量組 2.28±0.51 GRbl高劑量組 1.66±0.65＊

表2 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6的含量比較（±s，n＝8）

表2 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6的含量比較（±s，n＝8）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與溶媒組比較。

組別 TNF-α含量（pg／g.pro）IL-6的含量（pg／g.pro）假手術(shù)組 75.83±9.20＊＊ 44.67±16.42＊＊溶媒組 142.18±22.43 82.41±21.33 GRbl低劑量組 120.35±17.04＊ 75.58±23.09 GRbl高劑量組 98.29±20.62＊＊ 61.42±16.67＊＊

圖1 p-JAK2和p-STAT3免疫組織化學(xué)染色影像學(xué)表現(xiàn)（×400）

2.3 GRbl對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后p-JAK2，p-STAT3表達(dá)的影響 假手術(shù)組未見p-JAK2和p-STAT3免疫陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，而在溶媒組可見到缺血側(cè)大量的深棕色陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，主要集中在缺血半暗帶，在缺血核心區(qū)也有少量表達(dá)。GRbl高劑量組、低劑量組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見圖1～2。

圖2 p-JAK2和p-STAT3免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性表達(dá)累積光密度值

3 討 論

缺血性卒中損傷涉及的病理機(jī)制極為復(fù)雜。諸多證據(jù)顯示，炎癥事件介導(dǎo)缺血再灌注損傷的病理進(jìn)程［4］。炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等扮演著重要角色，最終導(dǎo)致神經(jīng)損傷與功能障礙。JAKs／STATs是細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激等介導(dǎo)的重要胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［5］。JAKs蛋白家族包括JAK1、JAK2、JAK3、TYK2，而 STATs 蛋 白 家 族 包 括 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。其中JAK2／STAT3與腦缺血密切相關(guān)。腦缺血及再灌注損傷導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6），生長(zhǎng)因子以及活性氧的產(chǎn)生和釋放，這些因子與特異受體結(jié)合激活JAKs使其酪氨酸殘基磷酸化，識(shí)別STATs的SH2區(qū)域并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，引起白細(xì)胞聚集于梗死外周區(qū)域，進(jìn)一步參與遲發(fā)性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)毒性作用，造成惡性循環(huán)。

人參是珍貴的多年生草本植物，具有補(bǔ)氣生血、安神益智、生津止渴之功效。GR是人參、三七等中藥材的主要有效成分，在臨床上尤其是神經(jīng)科得到廣泛的應(yīng)用。GR按二元的結(jié)構(gòu)可分為齊墩果酸型、原人參二醇型（如Rb1、R3）和原人參三醇型（Rg1），GRbl是其中含量最豐富的人參皂苷單體之一，其具有廣泛的藥理學(xué)活性，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等［6］。研究表明，GRbl能通過抗凋亡等保護(hù)腦缺血再灌注損傷［7-8］，而缺血后JAK2／STAT3信號(hào)通路異常激活導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，應(yīng)用JAK2特異性抑制劑AG490阻斷JAK2和STAT3的磷酸化，而且具有抗細(xì)胞凋亡作用［9］。GRbl能抑制缺血再灌注炎性反應(yīng)［10］，而IL-6、活性氧是選擇性激活JAK2／STAT1、STAT3的細(xì)胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)，GRbl通過JNK／p38MAPK信號(hào)途徑減輕神經(jīng)元tau蛋白的過度磷酸化，而阻斷MAPK的作用后，STAT的轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，表明 MAPK可能激活STAT的轉(zhuǎn)錄活性［11］。因此，GRbl有可能作用于腦缺血損傷中的JAK2／STAT3信號(hào)通路。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大腦缺血2h再灌24h后，大鼠有明顯的神經(jīng)行為學(xué)缺失癥狀，缺血側(cè)腦組織可見明顯的水腫以及蒼白色的梗死灶，腦組織中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的含量明顯增加。Acalovschi等［12］研究表明，IL-6加重腦缺血損傷，其水平與腦梗死體積相關(guān)，是神經(jīng)功能惡化的預(yù)警器。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，缺血側(cè)皮層p-JAK2和p-STAT3免疫陽(yáng)性表達(dá)提高，而先前文獻(xiàn)報(bào)道，缺血再灌注24h，磷酸化STAT3蛋白在缺血半暗帶區(qū)達(dá)高峰。本實(shí)驗(yàn)在給予人參皂苷處理后，大鼠神經(jīng)功能障礙減輕，腦組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6含量降低，p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)也明顯減少，表明GRbl可能通過抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的JAK2／STAT3信號(hào)途徑保護(hù)腦缺血再灌注損傷。

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