肝細胞生長因子及其受體與神經(jīng)纖毛蛋白1在骨肉瘤中的表達及意義

吳同申，孟 彥，彭圣智

（1.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，山東濟寧272029；2.山東大學第二醫(yī)院骨科，濟南250033；3.濟寧醫(yī)學院病理學教研室，山東濟寧272067）

骨肉瘤臨床中常見，患者進展較快，且病變進展與基因和蛋白有密切關(guān)系。肝細胞生長因子（HGF）又稱為離散因子，可以對肝細胞進行強烈而有效的刺激，引起肝細胞的再生。HGF在作用過程中可以與肝細胞生長因子受體（C-met）結(jié)合而發(fā)揮生物學作用。而C-met由原癌基因C-met編碼表達，C-met是Ⅱ型氨酸激酶受體，正常組織和細胞中表達極少，在惡性腫瘤中表達明顯升高［1］。HGF與C-met結(jié)合后可以促進多種腫瘤的增殖、遷移和血管的生成，對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要促進作用。神經(jīng)纖毛蛋白1（NRP1）是SEMA3F的受體，其不僅具有促進神經(jīng)導(dǎo)向因子的生長，而且在腫瘤中的作用受到學者的關(guān)注［2］。本實驗應(yīng)用免疫組織化學技術(shù)檢測骨肉瘤組織中HGF、C-met和NRP1的表達情況，并進行臨床對照觀察，探討其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院及山東大學第二醫(yī)院、山東大學齊魯醫(yī)院2008年1月至2010年11月骨肉瘤手術(shù)后的留取的蠟塊及臨床資料作為觀察組，納入均符合WHO在2008版中關(guān)于骨肉瘤的診斷標準，并重新切片并由病理醫(yī)師再次確診，患者術(shù)前均未進行放療和化療。本組共選取70例，男40例，女30例，年齡11～38歲，平均18.7歲。同時選取經(jīng)病理證實為正常的成熟骨組織并經(jīng)脫鈣后的蠟塊及臨床資料50例作為對照組，男26例，女24例，年齡12～36歲，平均17.8歲。2組在一般臨床特征中的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 HGF、C-met和NRP1蛋白的檢測 實驗用的兔抗人HGF、C-met和NRP1蛋白的濃縮液均購自中杉金橋生物技術(shù)公司，HGF、C-met和NRP1蛋白的檢測均應(yīng)用免疫組化二步法，均由病理技師進行操作，設(shè)陽性對照和陰性對照，嚴格質(zhì)量控制。

1.2.2 HGF、C-met和 NRP1蛋白的判斷方法 HGF、C-met和NRP1蛋白陽性染色定位于細胞質(zhì)和（或）細胞膜上，以出現(xiàn)棕黃的顆粒定為陽性細胞，選擇陽性細胞集中的區(qū)域（熱點區(qū)）并計數(shù)5個400倍視野的陽性表達細胞數(shù)，以平均每高倍鏡視野的陽性腫瘤細胞數(shù)大于或等于25%即判斷為陽性，以小于25%為陰性。計算陽性率。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計軟件進行分析，應(yīng)用χ2檢驗、相關(guān)分析及生存分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 2 組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達陽性率的比較觀察組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達的陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 觀察組中不同臨床特征患者HGF、C-met和NRP1蛋白表達的比較 觀察組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達的陽性率與腫瘤的轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、臨床分期及Ki67的表達密切相關(guān)，見表2。

2.3 觀察組中HGF、C-met和NRP1表達的相關(guān)性 經(jīng)線性相關(guān)分析顯示，觀察組中 HGF和 C-met（r＝0.47，P＝0.016 5）、HGF和 NRP1（r＝0.43，P＝0.031 2）、C-met和NRP1（r＝0.48，P＝0.010 9）的表達具有正相關(guān)性。

表1 2組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達陽性率的比較［n（%）］

表2 觀察組中不同臨床特征患者HGF、C-met和NRP1蛋白表達的比較［n（%）］

3 討 論

骨肉瘤在病變進展中增殖明顯，且出現(xiàn)明顯的浸潤和轉(zhuǎn)移。NRP1是細胞表面相對分子質(zhì)量為102×103的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其常表達在內(nèi)皮細胞和一些腫瘤細胞中，是Semaphorin3A和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的受體，在神經(jīng)軸突的生長、血管的生成及腫瘤的轉(zhuǎn)移中起重要作用［3］。也有觀點認為NRP1表達在所有腫瘤細胞中，即分布在腫瘤血管內(nèi)皮細胞上，也直接分布在腫瘤細胞中［4］。如果NRP1與VEGF結(jié)合，可以有效地促進腫瘤血管的生成及腫瘤細胞的增殖。也有人發(fā)現(xiàn)NRP1可以有效地下調(diào)腫瘤細胞間的黏附作用，使腫瘤細胞易于脫離原發(fā)灶而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［5］。HGF和C-met具有明顯的協(xié)同作用，其高表達時引起β2連環(huán)蛋白的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，使其不能與E-鈣黏蛋白胞內(nèi)部分結(jié)合形成復(fù)合體，破壞了E-鈣黏蛋白和細胞骨架的連接作用，最終引起細胞間的黏附作用減弱［6-7］。也有觀點認為HGF是通過增加整合素的功能活性，而不是改變其在細胞膜表面的表達量來促進細胞與胞外基質(zhì)成分的黏附作用［8］。多個學者的研究則顯示，HGF／C-met的作用過程中，對腫瘤的淋巴管生成也有重要促進作用［9-10］。因此HGF／C-met的作用可能是多元性的，其影響因素也較多。

研究結(jié)果顯示，觀察組中HGF、C-met和NRP1高表達，提示3種蛋白在腫瘤進展中有明顯的促進作用，也顯示出HGF、C-met和NRP1作為癌基因起到的類似作用。相關(guān)分析顯示HGF、C-met和NRP1之間均呈正相關(guān)性。由于HGF／C-met被認為是經(jīng)典的作用通路，而NRP1可以對此通路形成有效的促進作用，因此NRP1對HGF／C-met的表達有明顯的增強作用。由于NRP1、HGF／C-met均可以促進以VEGF誘發(fā)的血管生成，因此NRP1對 HGF／C-met的作用是否通過VEGF為中介分子尚有待更多實驗證實。本研究結(jié)果顯示，觀察組中HGF、C-met和NRP1蛋白表達的陽性率與腫瘤的轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、臨床分期及Ki67的表達密切相關(guān)，提示3種蛋白參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移、脈管浸潤和細胞的增殖過程。由于以上因素均與骨肉瘤的預(yù)后有關(guān)，因此聯(lián)合檢測 HGF、C-met和NRP1蛋白的表達可能對判斷預(yù)后有一定價值。即骨肉瘤中HGF、C-met和NRP1高表達患者的預(yù)后差。Ki67作為腫瘤細胞惡性增殖的重要指標，而HGF、C-met和NRP1均與Ki67表達的增殖指數(shù)有關(guān)，因此3種蛋白對腫瘤細胞的增殖也有明顯的促進作用，此結(jié)論也顯示出了HGF、C-met和NRP1高表達時的高增殖的腫瘤細胞，同時顯示出了高表達預(yù)示著患者的預(yù)后不良。

總之，骨肉瘤組織中 HGF、C-met和NRP1高表達，三者可能具有協(xié)同正向作用，使腫瘤快速生長、浸潤及轉(zhuǎn)移。術(shù)后聯(lián)合檢測HGF、C-met和NRP1的表達可能對判斷預(yù)后有一定價值。

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