毛細(xì)管區(qū)帶電泳法拆分維拉帕米對映體

王 樂，程曉昆，王婭莉，薛 娜，陳 晶，郭 麗

（1.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系藥物制劑教研室，河北石家莊050026；2.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司儀器分析研究室，河北石家莊050015；；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥品科，河北石家莊050011）

·論 著·

毛細(xì)管區(qū)帶電泳法拆分維拉帕米對映體

王 樂1，程曉昆2，王婭莉2，薛 娜1，陳 晶1，郭 麗3*

（1.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程系藥物制劑教研室，河北石家莊050026；2.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司儀器分析研究室，河北石家莊050015；；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥品科，河北石家莊050011）

目的以羥丙基環(huán)糊精為手性添加劑建立維拉帕米對映體的毛細(xì)管區(qū)帶電泳拆分方法。方法分別考察分離電壓、添加劑種類及濃度、緩沖溶液pH值等參數(shù)對實(shí)驗結(jié)果的影響，從而確定維拉帕米的最佳拆分條件。結(jié)果維拉帕米對映體得到了較好的分離，分離度可達(dá)5.52。結(jié)論該方法可用于維拉帕米對映體的分離，具有快速、準(zhǔn)確性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

維拉帕米；電泳，毛細(xì)管；環(huán)糊精類

維拉帕米（verapamil），又名異搏定（Isoptin），由罌粟堿衍生而得，是一種手性藥物，作為鈣通道阻滯劑被廣泛應(yīng)用于高血壓、心絞痛、心律失常、腦血管等疾病的治療［1－4］。有研究［5］表明，其鈣通道拮抗作用主要?dú)w因于（S）-異構(gòu)體，而（R）-異構(gòu)體的鈣通道拮抗作用僅為（S）-異構(gòu)體的1/10。為了使產(chǎn)品達(dá)到更好的療效并保障用藥安全性，對維拉帕米對映體進(jìn)行手性拆分研究具有重要意義。毛細(xì)管電泳因為快速、高效、微量等優(yōu)勢已被廣泛應(yīng)用于手性分離分析中［6－9］，β-環(huán)糊精及其衍生物作為手性選擇劑已被毛細(xì)管電泳等分離分析方法廣泛采用［10］。本文以羥丙基倍他環(huán)糊精（hydroxypropyl-βcyclodextrin，HP-β-CD）作為手性選擇劑，建立了維拉帕米對映體的毛細(xì)管區(qū)帶電泳拆分方法，達(dá)到了較好的分離效果，且快速便捷、準(zhǔn)確性好、成本低，可用于維拉帕米對映體的手性分離。

1 材料與方法

1．1 儀器：高效毛細(xì)管電泳儀（北京彩陸科學(xué)儀器有限公司，中科院研究生院應(yīng)用化學(xué)所），內(nèi)設(shè)可變波長的紫外檢測器；HW-2000色譜工作站（南京千譜軟件有限公司）；BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PHs-3C型酸度計（上海精科儀器有限公司）。

*通訊作者

1．2 試藥：S-維拉帕米（S-verapamil，S-VP）和R-維拉帕米（R-verapamil，R-VP）均購自上海禾豐制藥有限公司（分析純）；磷酸與磷酸二氫鈉均購于天津市美琳工貿(mào)有限公司（分析純）；HP-β-CD（山東新大精細(xì)化工有限公司，分析純）；去甲萬古霉素（華北制藥華勝有限公司，分析純）；氫氧化鈉（天津市華東試劑廠，分析純）；其他所用試劑均為分析純。實(shí)驗用水均為超純水。

1．3 方法

1．3．1 溶液配制：稱取S-VP、R-VP各5 mg，分別用超純水定容至5g/L。實(shí)驗時，各取上述儲備液0.1mL，用超純水定容至1mL，配制成0.5g/L維拉帕米對映體的混合溶液。

1．3．2 電泳條件：未涂層熔硅石英毛細(xì)管柱（內(nèi)徑50μm，柱長53cm，有效長度45cm，邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司）；運(yùn)行緩沖溶液含100mmol/L磷酸二氫鈉、20mmol/L HP-β-CD，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0；檢測波長254nm，分離溫度20℃，分離電壓10kV；樣品采用重力進(jìn)樣，進(jìn)樣高度17cm，進(jìn)樣時間3s。

每次進(jìn)樣之前，毛細(xì)管柱用0.1mol/L NaOH溶液沖洗5min，超純水沖洗10min，緩沖溶液平衡10min；緩沖溶液和試液均經(jīng)過0.45μm微孔濾膜過濾，超聲脫氣后使用；每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3次。

2 結(jié) 果

分別將S-VP對照品溶液、R-VP對照品溶液和按照2.1方法配制的維拉帕米對映體混合溶液注入高效毛細(xì)管電泳儀（見圖1～3）。在1.3.2所示電泳條件下，維拉帕米對映體得到了較好分離，分離度達(dá)5.52。

圖1 S-VP對照品溶液電泳圖Figure 1 Electrophoregram of S-VP

圖2 R-VP對照品溶液電泳圖Figure 2 Electrophoregram of R-VP

圖3 維拉帕米對映體分離電泳圖Figure 3 Electrophoregram of verapamil enantiomers

2．1 運(yùn)行電壓的選擇：在5～15kV范圍內(nèi)考察了分離電壓對分離度的影響（圖4）。實(shí)驗結(jié)果表明，電壓較低時，分析所用時間較長，譜峰拖尾嚴(yán)重，分離度較小；而電場強(qiáng)度過大時，所產(chǎn)生的大量焦耳熱會導(dǎo)致不均勻的溫度梯度和局部的黏度變化而引起區(qū)帶展寬，使得分離效率下降。最終選擇10kV作為分離電壓。

圖4 運(yùn)行電壓對維拉帕米對映體分離度的影響Figure 4 Influence of voltage on the resolution of verapamil enantiomers

2．2 手性添加劑的選擇：正確構(gòu)建手性環(huán)境是分離手性分子的關(guān)鍵。本文分別考察了HP-β-CD和去甲萬古霉素作為手性添加劑對維拉帕米對映體分離的影響（圖5）。實(shí)驗結(jié)果表明，HP-β-CD作為手性添加劑其濃度達(dá)到10mmol/L，對映體就有明顯的分離效果；而去甲萬古霉素在1.0～5.0mmol/L濃度范圍內(nèi)對映體均無分離效果。由于去甲萬古霉素有紫外吸收，濃度繼續(xù)增加會導(dǎo)致儀器噪音嚴(yán)重增加，基線不穩(wěn)定，因此本實(shí)驗選擇HP-β-CD為手性

添加劑。

圖5 不同手性選擇劑拆分維拉帕米對映體的色譜圖A.4mmll/L去甲萬古霉素；B.10mmol/L羥丙基倍他環(huán)糊精Figure 5 Chromatograms of verapamil enantiomers separated by norvancomycin and HP-β-CDA.4mmol/L norvancomycin；B.10mmol/L HP-β-CD

2．3 HP-β-CD濃度的選擇：分別配制10、15、20、25、30、40mmol/L的HP-β-CD緩沖溶液，考察HP-β-CD濃度對維拉帕米對映體分離效果的影響（圖6）。實(shí)驗結(jié)果顯示，在0～25mmol/L范圍內(nèi)分離度隨HP-β-CD濃度的增加而逐漸增大；而超過25mmol/L后HP-β-CD濃度繼續(xù)增加，分離度則有下降的趨勢。S-VP和R-VP的理論塔板數(shù)分別在15mmol/L和20mmol/L之后出現(xiàn)明顯下降的趨勢。綜合分離度和理論塔板數(shù)兩方面因素考慮，本文選擇HP-β-CD的濃度為20 mmol/L。

圖6 HP-β-CD濃度對理論塔板數(shù)及分離度的影響▼R-VP理論塔板數(shù)；●S-VP理論塔板數(shù)；■分離度Figure 6 Influence of concentration of HP-β-CD on the resolution of Verapamil enantiomers▼plate number of R-VP；●plate number of S-VP；■resolution

2．4 緩沖液pH值的選擇：在電泳中緩沖液的pH值是影響分離效果的重要因素之一，通過調(diào)整pH值可以優(yōu)化分離度。本實(shí)驗考察了緩沖溶液pH值在4～6.5范圍內(nèi)對維拉帕米對映體的分離效果的影響，結(jié)果表明緩沖液pH在4～6范圍內(nèi)，分離度隨pH增加而增大；而pH＞6之后分離度逐漸下降，因此確定電泳中緩沖液的pH值為6。

2．5 精密度的考察：以S-VP為例，其日間（n＝6）和日內(nèi)（n＝6）測定的峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為3.1％和2.7％，柱效的RSD分別為2.8％和3.3％。結(jié)果表明，該方法的精密度較高，重現(xiàn)性較好。

3 討 論

本文建立了以HP-β-CD做手性添加劑采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳拆分維拉帕米對映體的方法。實(shí)驗結(jié)果表明，該對映體在6min之內(nèi)即達(dá)到了良好的分離效果。本方法體系簡單、易操作、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、分析成本低，且不污染環(huán)境，為維拉帕米對映體的分離檢測提供了良好的依據(jù)。

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（本文編輯：劉斯靜）

CHIRAL SEPARATION OF VERAPAM IL ENANTIOMERS BY CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS

WANG Le1，CHENG Xiaokun2，WANG Yali2，XUE Na1，CHEN Jing1，GUO Li3*
（1．Department of Pharmaceutical Engineering，Hebei Chemical＆Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026，China；2．New Drug R＆D Center，North China Pharmaceutical Corporation，Shijiazhuang 050015，China 3．Department of Pharmacy，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China）

Objective To establish a method of capillary zone electrophoresis for the chiral separation of verapamil enantiomers using hydroxypropyl-β-cyclodextrin as the chiral selector.MethodsStudieswere performed with several parameters，i.e.the running voltage，pH of the running buffer，type and concentration of the additives.ResultsVerapamil enantiomers were separated well with the resolution of 5.52.ConclusionThe Results indicate that thismethod is accurate and suitable for the chiral separation of verapamil enantiomers.

verapamil；electrophoresis，capillary；cyclodextrins

R917

A

1007-3205（2013）05-0556-03

2012－12－04；

2013－01－17

王樂（1978－），男，河北保定人，河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事藥物制劑及質(zhì)量控制研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.021