毛囊單位促進組織工程皮膚形成的體外實驗研究

管 樂 肖 苒 曹 誼 林嚴笠 景偉明

毛囊單位促進組織工程皮膚形成的體外實驗研究

管 樂 肖 苒 曹 誼 林嚴笠 景偉明

目的通過插入分離的毛囊單位，構建帶有皮膚附屬器的組織工程皮膚，探討毛囊對組織工程皮膚形成的作用。方法將頭皮分離成毛囊單位，插入由Ⅰ型鼠尾膠原、成纖維細胞和角質形成細胞構建的組織工程皮膚模型中，浸沒培養(yǎng)1周，氣-液界面培養(yǎng)3周。通過鏡下觀察、HE染色和免疫組化檢測組織工程皮膚和毛囊的生長狀態(tài)。結果相對于懸浮培養(yǎng)的毛囊，實驗組毛囊體外生長期延長，結構更完整。HE染色顯示，實驗組組織工程皮膚可見毛囊和皮脂腺存在。免疫組化染色顯示，帶有毛囊的組織工程皮膚中可見反映基底膜完整性的Laminin和Ⅳ型膠原呈線狀連續(xù)分布于表皮、真皮連接處；而反應表皮成熟度的CK4和CK10/13則呈陽性分布于基底上層非角化細胞。結論復合毛囊單位可以促進組織工程皮膚表皮組織的分化和成熟。本方法為組織工程皮膚的構建和毛囊的體外培養(yǎng)提供了新的思路和方法。

組織工程皮膚毛囊角質形成細胞成纖維細胞

組織工程皮膚技術發(fā)展迅速，已經從實驗室走向了臨床應用。雖然目前構建組織工程皮膚的材料和方法有很多，但皮膚附屬器的欠缺仍然是組織工程皮膚構建亟須解決的問題[1]。沒有附屬器的組織工程皮膚只能作為一種敷料覆蓋創(chuàng)面，促進愈合，與真正的皮膚還有很大差距。大量文獻報道，表皮細胞和真皮細胞對于毛囊生長周期有調控作用[2-3]，而毛囊對于皮膚的修復[4-5]、免疫[6]等方面也有重要作用。本實驗首次將分離出的生長期完整毛囊植入由人角質形成細胞、成纖維細胞及鼠尾膠原所構建的組織工程皮膚中，構建帶有皮膚附屬器的組織工程皮膚，并探討毛囊單位對組織工程皮膚形成的作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

角質形成細胞和成纖維細胞來源于臨床乳房縮小術后切除的正常皮膚。毛發(fā)來源于移植或除皺手術后切除的正常頭皮。標本提供者均身體健康。所有標本均取得患者知情同意，獲醫(yī)院倫理委員會批準。所有標本離體后即放入盛有0℃生理鹽水的無菌器皿中。

1.2 試劑和儀器

主要試劑：特級胎牛血清（FBS），HG-DMEM培養(yǎng)基，青鏈霉素，胰酶，Williams E無血清培養(yǎng)基，谷氨酰胺，I型膠原酶（GIBCO公司，美國）；PBS，氫化可的松，牛胰島素，轉鐵蛋白（Sigma公司，美國）；HEPES（Amersco公司，美國）；亞硒酸鈉（北京化學試劑公司）；青鏈霉素（Heclone公司，美國）；I型鼠尾膠原（生友生物技術有限公司）。

主要設備：層流超凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司）；飽和濕度恒溫CO2培養(yǎng)箱，Megafuge離心機（Thermo Scientific，美國）；CO2恒溫孵育箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）；渦旋混勻器（Scientific instrument，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus BX5，日本）；顯微鏡數(shù)碼相機（Nikcon Eclipese 80i，日本）；顯微鏡（Leica Dm3000圖像分析系統(tǒng)，德國）；電熱恒溫水浴箱（上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 毛囊培養(yǎng)基的配置

在Williams E無血清培養(yǎng)基中加入終濃度為2 mmol/L谷氨酰胺、2 mmol/L Hepes（羥乙基哌嗪乙磺酸）、10 μg/L氫化可的松、10 mg/L轉鐵蛋白、10 μg/L亞硒酸鈉、105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素。使用前加入牛胰島素10 mg/L。

1.3.2 毛囊的分離和培養(yǎng)

頭皮用PBS沖洗3遍，75%乙醇紗布擦洗消毒，移至另一無菌培養(yǎng)皿中再次PBS沖洗。手術刀片逐次切取分離頭皮至單個毛囊單位。肉眼選取毛乳頭飽滿、外形光滑圓潤、顏色較黑的毛囊，鏡下再次挑選毛乳頭完整、內外根鞘無分離的完整毛囊單位備用。將挑選出的毛囊單位置于24孔板中（1根/孔），加入配置好的Williams E培養(yǎng)基，每孔0.5 mL。0.5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每3天換液1次。

1.3.3 角質形成細胞的培養(yǎng)

標本用無菌PBS反復沖洗剪去皮下脂肪，切成寬約2 mm的皮條，75%乙醇浸泡15 min，無菌PBS再次沖洗。將皮條置入0.25%的中性蛋白酶溶液中4℃消化過夜。無菌PBS沖洗后，輕輕撕開表皮層和真皮層（真皮層待用）。表皮層用0.05%胰酶-0.02% EDTA溶液37℃消化15 min，加入5~10倍體積的含血清DMEM終止消化，反復吹打、過濾。1 000 r/min離心濾液，棄上清，加入角質形成細胞培養(yǎng)基，計數(shù)，調整細胞濃度為1×106cells/mL。接種入皿，CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，5 d后換液，以后每3天換液1次，傳至第4代備用。

1.3.4 成纖維細胞的培養(yǎng)

將獲得的真皮層剪成芝麻大小顆粒，置入0.25%的Ⅰ型膠原酶溶液中，37℃消化3 h，加入5~ 10倍體積的完全培養(yǎng)基反復吹打，過濾，1 000 r/min離心濾液，培養(yǎng)5 d后換液，以后每3天換液1次。細胞融合后用0.25%胰酶-0.1%EDTA消化5 min，按1∶2傳代，傳至第3代備用。

1.3.5 組織工程皮膚（對照組）的制備

每毫升人成纖維細胞鼠尾膠原混合液配制：取第3代的人成纖維細胞2×105個，完全培養(yǎng)基混合制成760 μL的細胞懸液，置冰浴中備用。將200 μL的Ⅰ型鼠尾膠原蛋白（5 mg/mL）加入12 μL濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液中，立即混勻。加入23 μL的10×DMEM培養(yǎng)基，混勻，調整pH值為7.0，加入至細胞懸液中混勻。立即入六孔板中，每孔4.81 mL，厚度至0.5 cm。將六孔板在室溫下放置20 min，待膠凝固。膠凝固后在膠的表面分3次種植角質形成細胞，共2×105個，每次間隔30 min左右。同時每次種植前用注射器針頭在膠原上輕打小孔，刺入膠原而不刺穿。最后一次植入完成后，加入適當體積的角質形成細胞培養(yǎng)基，轉移到CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。5 d后，將組織工程皮膚用共培養(yǎng)小室抬起，加入1∶1的完全培養(yǎng)基和角質形成細胞培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基液面剛好接近組織工程皮膚的表面，CO2培養(yǎng)箱37℃氣-液界面培養(yǎng)3周，每天換液1次。

1.3.6 帶有毛囊的組織工程皮膚（實驗組）的制備和培養(yǎng)

挑選毛乳頭較大、顏色較深的毛囊，采用臨床毛發(fā)植入的方法將毛囊植入未鋪角質形成細胞的鼠尾膠原成纖維細胞混合物底層，每孔（六孔板）植入15根左右。植入完成后，分次鋪入角質形成細胞混懸液。加入1/3完全培養(yǎng)基，1/3表皮細胞培養(yǎng)基和1/3毛囊培養(yǎng)基，共3 mL，浸沒培養(yǎng)1周，48 h換液1次。1周后用共培養(yǎng)小室將皮膚抬起，氣-液界面培養(yǎng)3周。

1.3.7 組織學檢查

培養(yǎng)4周后，10%中性福爾馬林固定48 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色觀察。

1.3.8 免疫組化染色

4周后做石蠟切片。脫蠟和水化方法同HE染色，免疫組化染色按試劑盒步驟操作。

2 結果

2.1 組織工程皮膚大體和鏡下觀察

利用鼠尾膠原制作的組織工程皮膚在48 h后可見收縮，72 h后收縮明顯，4～5 d后收縮至最小狀態(tài)。實驗組收縮速度較對照組皮膚稍快。并且隨著皮膚收縮，插入方向一致的毛發(fā)出現(xiàn)方向改變。經過培養(yǎng)基浸沒培養(yǎng)和氣-液界面培養(yǎng)后，組織工程皮膚可見干燥、光滑的表面形成。倒置顯微鏡下觀察可見實驗組皮膚表面有較多圓形、顆粒狀角質形成細胞附著和生長，數(shù)量明顯多于對照組（圖1）。

2.2 實驗組毛囊與懸浮培養(yǎng)毛囊的生長

實驗組毛囊培養(yǎng)至15 d時，各層結構仍較清晰；毛乳頭呈橢圓形，形態(tài)飽滿，呈生長狀態(tài)；成纖維細胞呈放射狀圍繞在毛囊周圍。至第4周時，毛發(fā)內外根鞘結構模糊，毛乳頭至毛根距離縮短，出現(xiàn)老化死亡的現(xiàn)象。而體外懸浮培養(yǎng)毛囊在第7、8天時就可見結構模糊，第15天時即出現(xiàn)老化死亡現(xiàn)象。相較之下，實驗組毛乳頭縮短明顯延遲，并在培養(yǎng)的過程中未見毛乳頭的脫落和彎折，而懸浮培養(yǎng)毛囊在第7、8天時即可見毛乳頭的彎折和脫落現(xiàn)象（圖2）。

2.3 組織工程皮膚組織學檢測

HE染色觀察實驗組組織工程皮膚，可見毛囊和皮脂腺存在，表皮層形成均勻；從基底層向上可見角質形成細胞輪廓由立方形漸趨扁平；表皮與真皮層連接較為緊密；毛囊附近的表皮分化程度更高，與毛囊的外根鞘相連成一整體；毛囊結構仍可見分層，但部分細胞退化、死亡，僅殘留胞核或細胞陰影。對照組皮膚的角質形成細胞未見明顯分化，表皮層易與真皮分離。

表皮基底膜和表皮細胞分化標志的免疫組化染色顯示，帶有毛囊的組織工程皮膚中可見反映基底膜完整性的Laminin和Ⅳ型膠原呈線狀連續(xù)分布于表皮、真皮連接處，而反應表皮成熟度的CK4和CK10/13則呈陽性分布于基底上層非角化細胞。特別是靠近毛囊附近的表皮層中陽性染色更為明顯。而對照組則幾乎看不到陽性染色（圖3）。

圖1 組織工程皮膚大體觀和鏡下觀，F(xiàn)ig.1 The gross and histological observation of tissue-engineered skin in each group

圖2 實驗組毛囊和體外懸浮培養(yǎng)毛囊7 d、21 d和28 d變化情況Fig.2 The histological observation of hair follicle cultured for 7,21 and 28 days in each group

圖3 各組組織工程皮膚HE染色（光學顯微鏡，100×）和免疫組化染色（光學顯微鏡，200×）Fig.3 HE(Optical microscope,100×)and immunohistochemical staining(Optical microscope,200×)of tissue-engineered skin in each group

3 討論

本研究中，我們將分離出的毛囊單位插入由角質形成細胞、成纖維細胞和Ⅰ型鼠尾膠原構成的組織工程皮膚中，構建了帶有毛囊的組織工程皮膚，并且發(fā)現(xiàn)組織工程皮膚的基底膜形成更完整，角質形成細胞數(shù)量明顯增多，表皮組織的分化和成熟度較高，毛囊周圍的表皮層與外根鞘連接成一整體。Michel等[8]曾將分離出的單根毳毛插入由4片人成纖維細胞膜所構成的真皮中，形成的組織工程皮膚的表皮分化良好。毛囊細胞與皮膚中的角質形成細胞和成纖維細胞之間有著密切的聯(lián)系，可能這些細胞之間的相互作用促進了組織工程皮膚表皮的生長和成熟，其機制有待進一步研究。

同時，毛囊在組織工程皮膚上保持生長狀態(tài)的時間比單獨懸浮培養(yǎng)明顯延長，培養(yǎng)期間未見毛乳頭損壞現(xiàn)象。該現(xiàn)象與Roger等[7]將分離出的鼠胡須插入明膠氣-液界面培養(yǎng)的表現(xiàn)一致。他們認為，這可能是由于毛發(fā)生長的環(huán)境本就是一個氣-液界面，懸浮培養(yǎng)方式將毛囊浸沒在液體中，改變了毛發(fā)的生存環(huán)境，導致毛發(fā)體外的存活時間較短。當使用明膠對毛囊進行3-D培養(yǎng)時，重建了毛囊正常的生存環(huán)境，從而明顯延長了毛發(fā)的生長期。但是，他們只是將分離出的鼠毛囊插入到明膠中，并沒有混合細胞。本實驗中，構建組織工程皮膚的角質形成細胞和成纖維細胞對于毛囊的體外生長可能也發(fā)揮了一定作用。

正常皮膚組織有明顯的表皮突和真皮乳頭，這種連接增加了表皮和真皮之間接觸的面積，具有重要的生理意義。但以往構建的組織工程皮膚欠缺這一生理結構。本實驗采取分次間隔的方法，3次植入角質形成細胞，同時每次植入前后在膠原上打孔，希望角質形成細胞能夠進入小孔中形成類似表皮突和真皮乳頭的結構。盡管在其后的切片中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的表皮突和真皮乳頭類結構，但已經可以觀察到一些小突起連接，今后可以進一步改善方法。

另外，在氣-液培養(yǎng)4周之后，組織工程皮膚中心部分毛囊的細胞結構大部分消失，真皮中細胞數(shù)量也有所減少。這可能是由于為了固定插入的毛囊，所制作的組織工程皮膚較厚，培養(yǎng)基不能充分滲透，中心部分的細胞和毛囊不能獲得充分的營養(yǎng)所致。

本實驗通過插入分離的完整毛囊單位，建立了帶有皮膚附屬器的組織工程皮膚，并且所構建的組織工程皮膚表皮成熟度更高，基底膜形成更完整，毛囊的體外生存期明顯延長。

[1]Horch RE,Kopp J,Kneser U,et al.Tissue engineering of cultured skin substitutes[J].Cell Mol Med,2005,9(3)：592-608.

[2]Yang JS,Lavker RM,Sun TT.Upper human hair follicle contains a subpopulation of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential[J].J Invest Dermatol,1993,101(5)：652-659.

[3]Jahoda CA.Induction of follicle formation and hair growth by vibrissa dermal papilla implanted into rat ear wounds：vibrissatype fobres are specified[J].Development,1992,115(4)：1103-1109.

[4]王洪濤,陳璧,胡大海.毛囊干細胞參與創(chuàng)面修復及相關的信號轉導通路[J].中國修復重建外科雜志,2007,21(1)：90-93.

[5]Jahoda CA,Reynolds AJ.Hair follicle dermal sheath cells：unsung participants in wound healing[J].Lancet,2001,358(9291)：1445-1448.

[6]Nagao K,Kobayashi T,Moro K,et al.Stress-induced production of chemokines by hair follicle regulates the trafficking of dendritic cells in skin[J].Nature,2012,13(8)：744-754.

[7]Rogers G,Martinet N,Steinert P,et al.Cultivation of murine hair follicle as organoids in a collagen matrix[J].J Invest Dermatol, 1987,89(4)：369-379.

[8]Michel M,L’heureux N,Pouliot R,et al.Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,1999,35(6)：318-326.

Hair Follicle Units Improving the Construction of Tissue Engineered Skin in Vitro

GUAN Yue,XIAO Ran,CAO Yilin，YAN Li,JING Weiming.Department of Research Center,Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical Collage, Beijing 100144,China.Corresponding author:XIAO Ran(E-mail:xiaoran@pumc.edu.cn).

ObjectiveTo construct tissue-engineered skin with skin appendages by inserting isolated hair follicle units and to explore the effect of hair follicle units on the construction of tissue-engineered skin.MethodsSingle undamaged hair follicle units were dissected by surgical blades.Then hair follicle units were inserted to the engineered dermis including Rat tail tendon collagen type I,fibroblasts and Keratinocytes.After 1 week of submerged culture and 3 weeks of air-liquid culture,tissue-engineeredskinandthehairfollicleweredetectedbyinvertedmicroscope,HEstainingand immunohistochemical staining.ResultsHair follicle morphology could maintain more than 21 days without hair papilla damage,which was longer than those of free-floating culture.After 4 weeks,skin appendages such as hair follicle and sebaceous glands were found in the tissue engineered skin by HE staining.A continuous basement membrane was observed and associated with the expression of laminin and collagen IV by immunohistochemical staining.Keratinocytes seeded on the tissue with hair follicle units formed a stratified and cornified epidermis and expressed typical markers of differentiation (keratin4,keratin10/13).ConclusionInserting hair follicle units could promote the differentiation and mature of tissueengineered skin,which could provide a new way to construct tissue-engineered skin.

Tissue-engineered skin;Hair follicle;Keratinocytes;Fibroblasts

Q813.1+2

A

1673－0364（2013）02－0076－05

2013年1月19日；

2013年3月10日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.004

北京市科委科技計劃重大項目（D090800046609003；D09080703660901）。

100144北京中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院整形外科醫(yī)院研究中心。

肖苒（E-mail：xiaoran@pumc.edu.cn）。