利用軟骨細胞膜片技術(shù)在山羊皮下構(gòu)建軟骨樣組織的研究

陶 然 劉 浥 殷宗琦 汪振星 李 丹 周廣東

·論著·

利用軟骨細胞膜片技術(shù)在山羊皮下構(gòu)建軟骨樣組織的研究

陶 然 劉 浥 殷宗琦 汪振星 李 丹 周廣東

目的探討軟骨細胞膜片技術(shù)在大型哺乳動物體內(nèi)構(gòu)建軟骨的優(yōu)越性。方法以山羊耳廓軟骨細胞為種子細胞，分別利用細胞膜片技術(shù)（實驗組）和細胞復合PGA/PLA支架材料的方法（對照組）構(gòu)建軟骨組織。體外培養(yǎng)4周回植到動物腹部皮下，分別于回植前、回植后4周及回植后8周時采集標本，觀察比較兩組軟骨形成情況。結(jié)果體外培養(yǎng)4周后，兩組均形成一定量的軟骨樣組織，但對照組可見未降解的材料纖維；體內(nèi)構(gòu)建4周后，實驗組形成成熟軟骨樣組織，對照組為纖維結(jié)締組織替代，伴有大量炎性細胞浸潤；體內(nèi)培養(yǎng)8周時，實驗組較4周前無明顯變化，對照組體積明顯縮小，仍為纖維結(jié)締組織。結(jié)論軟骨細胞膜片技術(shù)與細胞復合PGA/PLA支架材料構(gòu)建組織工程軟骨方法相比，原代細胞用量少，體外培養(yǎng)時間短，在大動物體內(nèi)能形成成熟軟骨，具有更廣泛的臨床應用前景。

組織工程化軟骨細胞膜片聚乙酸聚乳酸炎癥反應

目前，聚乙酸（Polyglycolic acid，PGA）/聚乳酸（Polylactic acid，PLA）混合材料是體內(nèi)外構(gòu)建組織工程化軟骨最常用的支架材料之一。我們的前期研究證明，用PGA/PLA支架材料，不論是混合軟骨細胞還是骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs），均能在體外構(gòu)建出具有一定生物力學強度的軟骨樣組織，也能于裸鼠體內(nèi)構(gòu)建出成熟的軟骨樣組織[1-2]。但以PGA/PLA支架材料構(gòu)建軟骨也存在一些缺點。我們發(fā)現(xiàn)，由于軟骨細胞在體外擴增過程中容易出現(xiàn)老化，而以PGA/PLA支架材料構(gòu)建軟骨，要求種子細胞快速大量分泌細胞外基質(zhì)，所以接種至PGA/PLA支架材料的軟骨細胞通常選擇第1代，因此對原代細胞的需求量大。另外，PGA/PLA支架材料在具有完全免疫功能的大動物體內(nèi)，會引起嚴重的炎癥反應，影響軟骨組織的構(gòu)建[1，3]。

為了在大型哺乳動物體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨，我們嘗試選擇無支架材料的構(gòu)建方式[4-6]。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，通過高密度接種軟骨細胞，可以在體外構(gòu)建出較大體積的軟骨樣復層細胞膜片。由于軟骨細胞在堿性成纖維生長因子存在時[7]，在三維空間中互相接觸，會維持分化現(xiàn)象[8]。這種技術(shù)對軟骨細胞的代次要求較低，第4代的軟骨細胞也可構(gòu)建出軟骨樣組織，大大降低了對原代細胞的需求量。

為了進一步證實該技術(shù)在構(gòu)建組織工程軟骨，尤其是在大型哺乳動物體內(nèi)構(gòu)建軟骨中的重要性，本研究將軟骨細胞膜片技術(shù)和PGA/PLA材料細胞混合構(gòu)建技術(shù)的部分參數(shù)及構(gòu)建結(jié)果進行比較。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本組5只山羊均來源于上海甲干生物科技有限公司，雌雄不限，平均體質(zhì)量（20.0±3.0）Kg。實驗過程中均依照實驗動物保護指南的要求進行。每只動物左側(cè)腹部皮下回植軟骨細胞膜片（實驗組，n=5），右側(cè)腹部皮下回植PGA/PLA細胞材料復合物（對照組，n=5）。

1.2 實驗材料

胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Worthington公司，美國）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Hyclone公司，美國）；細胞計數(shù)數(shù)據(jù)盒（CCK-8，東仁化學科技有限公司，上海）；無紡PGA纖維（組織工程國家工程中心）。

1.3 原代細胞的獲取及擴增

每只動物取約2.0 cm×2.0 cm大小的耳廓軟骨，將軟骨塊剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，震蕩消化30 min，然后沖洗3遍，加入0.25%Ⅱ型膠原酶，震蕩消化7~8 h[7]。獲得的消化液用100 μm細胞濾網(wǎng)過濾，離心，去上清液，沉淀的細胞用高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，所得細胞以1×104cells/cm2的濃度接種在100 mm培養(yǎng)皿上，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清、2 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（軟骨細胞培養(yǎng)液）培養(yǎng)擴增，待軟骨細胞生長至70%~80%融合時進行傳代[9]。

1.4 繪制細胞生長曲線

將不同代次的細胞以2 000個/孔接種于96孔板，用軟骨細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。每個96孔板接種一個代次的細胞，每板接種5行，每行接種5個孔。分別于第1、3、5、7、9天進行細胞計數(shù)。每次計數(shù)每板中的一行，先將培養(yǎng)基吸盡，加入100 μL DMEM及10 μL CCK-8試劑，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度，繪制細胞生長曲線。

1.5 材料/細胞混合物的制備

15 mg無紡PGA纖維制成1.0 cm×1.0 cm×0.1 cm大小，將1%PLA二氯甲烷溶液均勻滴在PGA纖維上，使PGA/PLA混合材料總質(zhì)量達到16.5 mg[10]。75%乙醇消毒，PBS沖洗3次。將第1代軟骨細胞用軟骨細胞培養(yǎng)液制備成6×107cells/mL濃度的細胞混懸液，均勻滴在PGA/PLA支架材料上。在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h[9]，加入軟骨組織培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，10 ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子-β1，1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。體外培養(yǎng)4周后，將PGA/PLA細胞材料復合物植入山羊腹部皮下。

1.6 細胞膜片的制備

留取一100 mm培養(yǎng)皿的第1代細胞（基礎皿），每3天用軟骨組織培養(yǎng)液換液一次，直至制備細胞膜片。將第4代軟骨細胞消化，離心，重懸，以8×105cells/cm2濃度接種于之前留取的第1代細胞上，以軟骨組織培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液。體外培養(yǎng)4周時，可在培養(yǎng)皿中揭起一直徑100 mm的軟骨細胞膜片，將膜片切割成1.0 cm×1.0 cm大小，每兩塊疊加在一起回植于皮下組織內(nèi)，剩余部分用于組織學檢測。

1.7 組織學檢測

每組分別于回植前（體外培養(yǎng)4周）、體內(nèi)培養(yǎng)4周和體內(nèi)培養(yǎng)8周時，各取5個樣本，觀察大體外觀。然后，將標本以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋及切片（5 μm厚），行HE染色及油紅-O染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細胞外基質(zhì)分泌情況。免疫組織化學染色檢測Ⅱ型膠原的表達情況，證明構(gòu)建組織的軟骨表型[11]。

1.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以（均值±標準差）表示，應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05時差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同代次軟骨細胞生長曲線

添加了堿性成纖維生長因子的軟骨細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)軟骨細胞后，軟骨細胞在形態(tài)上沒有出現(xiàn)明顯老化的表現(xiàn)。光鏡下原代至第4代間的軟骨細胞，形態(tài)無明顯差異（圖1A-E）。生長曲線表明，不同代次的軟骨細胞在此培養(yǎng)體系下擴增能力無明顯差異（圖1F）。說明所用的軟骨細胞培養(yǎng)液具有維持軟骨細胞表型的功能。

2.2 體外培養(yǎng)4周、體內(nèi)培養(yǎng)4周及8周后構(gòu)建組織大體及組織學觀察

體外培養(yǎng)4周后，PGA/PLA細胞材料復合物維持原有大小形態(tài)；組織學檢測表明，已分泌大量細胞外基質(zhì)，形成部分軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，但仍有大量PGA/PLA材料未降解（圖2D-F）。高密度接種于培養(yǎng)皿上的軟骨細胞，在體外培養(yǎng)4周后已形成一片完整的膜片樣組織（圖2A），組織學證實為軟骨樣組織，分泌大量細胞外基質(zhì)，形成特異性軟骨陷窩（圖2B-C）。

體內(nèi)構(gòu)建4周后，大體觀察見實驗組形成成熟軟骨樣組織，大小沒有明顯改變；而對照組未形成軟骨樣組織（圖3A、E）；組織學檢測證實，實驗組形成成熟的軟骨組織（圖3B-D），而對照組未形成軟骨樣組織，為纖維結(jié)締組織，并有大量炎癥細胞浸潤（圖3F-H）。體內(nèi)構(gòu)建8周時，實驗組較體內(nèi)4周時無明顯變化（圖4A-D），對照組體積明顯縮小，組織學檢測仍為纖維結(jié)締組織（圖4E-H）。

圖1 不同代次軟骨細胞形態(tài)及生長曲線（100×）Fig.1 Morphological observation and growth curve of chondrocytes in different passage(100×)

圖2 體外培養(yǎng)4周構(gòu)建組織大體觀及組織學（100×）Fig.2 Gross view and histological observation of constructs in each group after cultured for 4 weeks in vitro(100×)

圖3 體內(nèi)4周組織大體觀及組織學（100×）Fig.3 Gross view and histological observation of tissue harvested in each group after implantation for 4 weeks(100×)

圖4 體內(nèi)8周組織大體觀及組織學（100×）Fig.4 Gross view and histological observation of tissue harvested in each group after implantation for 8 weeks(100×)

3 討論

目前，用軟骨細胞混合PGA/PLA支架材料體外構(gòu)建軟骨的組織工程技術(shù)已經(jīng)比較成熟。但是，該方法對軟骨細胞代次要求高。大量研究已經(jīng)證實[12-13]，軟骨細胞在體外擴增過程中易老化，喪失軟骨細胞特征性表型，分泌軟骨特異性細胞外基質(zhì)的能力明顯下降。而PGA/PLA支架材料構(gòu)建軟骨，要求隨著支架材料的降解，種子細胞能快速大量分泌細胞外基質(zhì)，所以用于接種PGA/PLA支架材料的軟骨細胞需要具備軟骨細胞表型及較強的分泌軟骨特異性細胞外基質(zhì)的能力，通常選擇第1代細胞，因此這種構(gòu)建方法需要大量的原代細胞，對供體造成的損傷比較大。另外，PGA/PLA支架材料雖然生物相容性好，和細胞親和性高，但是植入具有完全免疫功能的動物體內(nèi)后，其酸性降解產(chǎn)物會引起強烈的無菌性炎癥，嚴重影響軟骨組織形成。因此，我們排除支架材料可能引起炎癥反應的影響，單純利用細胞在大動物體內(nèi)構(gòu)建軟骨組織。

軟骨細胞在傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)體系下擴增培養(yǎng)時，隨著代次增高，會逐漸呈現(xiàn)老化的現(xiàn)象，喪失軟骨細胞特征性表型，Ⅱ型膠原分泌量減少，而代表成纖維細胞特征的Ⅰ型膠原分泌會增多[14-15]。但是，有研究指出，老化的軟骨細胞在“細胞堆積”的培養(yǎng)狀態(tài)下會出現(xiàn)再分化，重新表達軟骨細胞特征性表型，并分泌特征性的軟骨外基質(zhì)[16-17]。軟骨細胞分泌的基質(zhì)中含有轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、胰島素樣生長因子1（IGF-1），能誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化成為軟骨細胞，并維持軟骨細胞表型[18-19]。使用細胞膜片法時，基礎皿中的原代細胞軟骨表型特征明顯，能大量分泌軟骨細胞外基質(zhì)，在10 d左右就能形成薄層軟骨細胞膜。這為擴增所得的低代次細胞堆積再分化并維持其特征性表型提供了良好的條件，并能將擴增所得的細胞連成整體[5]。而這一方法也符合“細胞堆積”的理念。本實驗在軟骨細胞培養(yǎng)液中加入了堿性成纖維生長因子，這是一種促細胞分裂增殖活性的生長因子，能進一步提高軟骨細胞的擴增能力，降低軟骨細胞在擴增過程中出現(xiàn)老化的可能。研究結(jié)果證實，即使利用擴增至第4代的軟骨細胞，仍然能在體外構(gòu)建出軟骨樣組織，體積未縮小，具有一定的生物力學強度。

本實驗中，經(jīng)過體外培養(yǎng)4周，兩組都可在體外構(gòu)建出軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，但是實驗組形成的軟骨樣組織更致密，更成熟；對照組陷窩結(jié)構(gòu)較少，仍有PGA/PLA材料纖維殘留。在之前的研究中，我們通過延長體外培養(yǎng)時間至2周的方法，可以降低PGA/ PLA支架在兔體內(nèi)引起的炎癥反應[2]。我們認為，通過體外培養(yǎng)，分泌的軟骨細胞外基質(zhì)可以部分包裹PAG/PLA纖維，減少機體與材料的接觸，從而降低炎癥反應。本實驗將體外培養(yǎng)時間進一步延長至4周，希望材料進一步降解并被包裹。但大型哺乳動物的免疫功能較兔更加完整，即使體外培養(yǎng)延長至4周，殘留的少量PAG/PLA支架材料在實驗動物皮下產(chǎn)生的酸性降解產(chǎn)物就能激活具有完整免疫功能的大動物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，引起大量炎癥細胞浸潤，嚴重影響軟骨的形成[20]。因此，對照組在體內(nèi)4周和8周時，都不能形成軟骨樣組織。實驗組去除了材料引起炎癥反應的可能，單純植入細胞構(gòu)建成的軟骨樣組織，除手術(shù)創(chuàng)傷引起的炎癥反應外，不會引起其他的影響軟骨形成的免疫反應，所以在體內(nèi)構(gòu)建4周時，實驗組就可以形成成熟的軟骨樣組織，延長體內(nèi)構(gòu)建時間，對組織形成沒有明顯影響。

4 結(jié)論

利用軟骨細胞膜片技術(shù)構(gòu)建軟骨，與PGA/PLA細胞材料復合的構(gòu)建方法相比，具有原代細胞用量少、供區(qū)損傷小、可早期回植、在大動物體內(nèi)基本不引起炎癥反應等優(yōu)點。今后擬利用該項技術(shù)構(gòu)建特殊形狀的軟骨組織，以滿足不同部位軟骨缺損修復的需要，為實現(xiàn)軟骨組織工程技術(shù)的臨床應用奠定基礎。

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The Construction of Tissue Engineered Cartilage by Using Chondrocyte Cell-Sheet in Goat Model

TAO Ran,LIU Yi,YIN Zongqi,WANG Zhenxing,LI Dan,ZHOU Guangdong.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China. Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail:guangdongzhou@126.com).

ObjectiveTo investigate the advantage of cell-sheet technology in constructing tissue engineered cartilage (TE)in goat model.MethodsTE cartilage was constructed by auricular chondrocytes of goats as seed cells with cell-sheet technology(experimental group)and PGA/PLA cell-material compound method(control group).Then the TE cartilage was implanted subcutaneously in the abdominal wall of goats after cultured for 4 weeks in vitro.Tissue specimens were collected to evaluate the chondrogenesis in two groups at three time points：before implantation,4 weeks after implantation and 8 weeks implantation.ResultsAfter 4 weeks cultured in vitro,cartilage phenotype was displayed in two groups by histology analysis,but large amount of PGA fibers was also observed in control group.Mature cartilage tissues were formed in experimental group after implanted for 4 weeks and 8 weeks.On the contrary,all the constructions tuned into fibrous tissue in control group 4 weeks after implantation,and significant shrink of volume was observed in control group 8 weeks after implantation.ConclusionCell-sheet technology,compared with PGA/PLA cell-material compound method,has more advantages including limited defect in donor site,short culture period in vitro and less inflammatory response in vivo.It would provide a promising approach for the regeneration of cartilage in vivo.

Tissue engineered cartilage;Cell-sheet;Polyglycolic acid;Polylactic acid;Inflammatory response

Q813.1+2

A

1673－0364（2013）02－0061－05

2013年2月26日；

2013年3月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.001

國家高技術(shù)發(fā)展計劃重大專項（863項目）（2012AA020507）；國家自然科學基金項目（30973131，50830105，81000677）。

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科；200011上海市上海市組織工程研究重點實驗室；200241上海市組織工程國家工程中心。

周廣東（E-mail：guangdongzhou@126.com）。