IL-17、COX-2在口腔扁平苔蘚和口腔鱗癌中的表達(dá)分析

徐佳瑛 楊麗麗 馬 超 陳啟林

口腔癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高［1］，近年來在東亞國(guó)家及地區(qū)均有上升的趨勢(shì)?？谇话┤菀讖?fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為20% ～48%，5年生存率約60%，且部分患者發(fā)病年齡較低，有年輕化趨勢(shì)。近年來研究發(fā)現(xiàn)炎性因子可通過改變局部微環(huán)境而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而環(huán)氧化酶-2(COX-2)與細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)［2］。本研究通過觀察白介素-17(IL-17)與COX-2在口腔扁平苔蘚、口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，分析兩者的關(guān)系和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2009年1月至2012年1月我科初診的20例口腔扁平苔蘚和20例口腔鱗癌患者的病理組織為研究對(duì)象，分別納入扁平苔蘚組和鱗癌組。所有病理組織均取自手術(shù)切除并經(jīng)石蠟包埋處理，術(shù)前未進(jìn)行免疫、激素、放療、化療等相關(guān)治療，患者本身未合并其他自身免疫性疾病。選取20例正?？谇火つそM織作為對(duì)照組，均取自口腔外傷患者，排除口腔黏膜疾病或全身免疫系統(tǒng)疾病，鏡下組織表現(xiàn)為復(fù)層鱗狀上皮，包括基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層、角化層。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 超凈工作臺(tái)，微型常溫離心機(jī)，超純水及除菌系統(tǒng)，電冰箱，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡及數(shù)碼成像系統(tǒng)等。兔抗人IL-17單克隆抗體，購(gòu)自北京博奧森生物有限公司;抗COX-2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司;SP免疫組化試劑盒以及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物有限公司。

1.2.2 試驗(yàn)步驟 切片機(jī)連續(xù)切片，厚度取4 μm，并置于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上。常規(guī)脫蠟水洗后置于3%雙氧水中約10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶。室溫下采用檸檬酸緩沖液，微波加熱修復(fù)抗原，并以正常羊血清封閉20 min，蒸餾水沖洗后將載玻片上的水漬擦干。滴加一抗，37℃下孵育1 h，滴加山羊抗小鼠IgG，37℃下靜置30 min，然后滴加SP復(fù)合物，靜置30 min，DAB濃縮試劑盒顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，沖洗后蘇木精復(fù)染，然后脫水、透明、封片。所有實(shí)驗(yàn)步驟及操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行，設(shè)立陰性對(duì)照并將PBS代替一抗重復(fù)操作。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

所有切片均在鏡下隨機(jī)選取5個(gè)以上高倍視野(×400)觀察，淺黃色-棕褐色細(xì)顆粒狀為陽性表現(xiàn)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。按陽性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行分級(jí)，陽性細(xì)胞表達(dá)率＜10%為陰性(-)，≥10% ～20%為弱陽性(+)，＞20% ～50%為陽性 (++)，＞50%為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

研究數(shù)據(jù)均由SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05，以 P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17在正?？谇火つ?，口腔扁平苔蘚及口腔鱗癌組織中的表達(dá)

對(duì)照組中14例(70.0%)呈不同程度的陽性表達(dá)，主要位于胞質(zhì)，分布于顆粒層、角化層、部分棘細(xì)胞層，間質(zhì)細(xì)胞中可見少量陽性表達(dá);扁平苔蘚組19例(95.0%)呈陽性表達(dá)，主要在固有層淺層上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。鱗癌組中均有陽性表達(dá)，腫瘤細(xì)胞及周圍間質(zhì)細(xì)胞均可見陽性表達(dá)。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，IL-17在扁平苔蘚組與鱗癌組中的陽性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但扁平苔蘚組與鱗癌組IL-17陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，見表1。

表1 IL-17在正?？谇火つ?，口腔扁平苔蘚及口腔鱗癌組織中的表達(dá)(例)

2.2 COX-2在正?？谇火つぃ谇槐馄教μ\及口腔鱗癌組織中的表達(dá)

對(duì)照組中未見COX-2陽性表達(dá)，扁平苔蘚組中10例(50.0%)陽性表達(dá)，以細(xì)胞胞質(zhì)或核膜為主，多見于上皮棘細(xì)胞層、顆粒層以及角化層，基底細(xì)胞未見陽性表達(dá);在鱗癌組中16例(80.0%)陽性表達(dá)，鱗狀癌細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，COX-2在扁平苔蘚組與鱗癌組中的陽性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，且鱗癌組高于扁平苔蘚組(P ＜0.05)，見表2。

表2 COX-2在正?？谇火つ?，口腔扁平苔蘚及口腔鱗癌組織中的表達(dá)(例)

3 討論

口腔扁平苔蘚是口腔黏膜的慢性非感染性炎性疾病，Th1/Th2失衡等免疫因素在疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。因口腔扁平苔蘚具有癌變潛能，故WHO將其列入潛在惡性病變范疇。大量研究發(fā)現(xiàn)，口腔扁平苔蘚病損區(qū)以T淋巴細(xì)胞聚集為主，包括輔助性和抑制性T細(xì)胞，而B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞卻相對(duì)少見?；罨腡淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生多種炎性因子來調(diào)控、促進(jìn)免疫反應(yīng)過程，引起大量活化的T淋巴細(xì)胞在局部組織浸潤(rùn)［3］。部分 T淋巴細(xì)胞可分泌 IL-17(Th17亞群)，并可促進(jìn)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，促進(jìn)炎細(xì)胞因子分泌，在自身免疫性疾病中具有重要作用［4］。

口腔扁平苔蘚具有慢性持續(xù)性、免疫抑制功能降低，病變區(qū)可見毒性T細(xì)胞克隆等自身免疫性疾病的特征。目前在實(shí)體瘤與周圍間質(zhì)關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥過程中細(xì)胞因子的變化可影響局部微環(huán)境，進(jìn)而改變正常細(xì)胞的存活、增殖、分化周期，是腫瘤起始、進(jìn)展并具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵因素之一［5］。在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、肝癌、腸癌、乳腺癌惡性腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及IL-17;進(jìn)一步研究局部微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞可分泌MCP-1、促炎因子等，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化并維持其生長(zhǎng)過程［6］。本次研究發(fā)現(xiàn)，約30%的正常口腔黏膜組織不表達(dá)IL-17，70%陽性表達(dá)于胞質(zhì)，包括顆粒層、角化層、部分棘細(xì)胞層以及間質(zhì)細(xì)胞。95%扁平苔蘚組織IL-17呈陽性表達(dá)，多見于固有層淺層上皮細(xì)胞，而鱗癌組織中均有陽性表達(dá)，腫瘤細(xì)胞及周圍間質(zhì)細(xì)胞均可見陽性表達(dá)。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，IL-17在扁平苔蘚組與鱗癌組陽性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組，扁平苔蘚組與鱗癌組IL-17陽性率無顯著差異，但鱗癌組強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于扁平苔蘚組。IL-17在口腔扁平苔蘚、口腔鱗癌中均有高度表達(dá)，提示口腔扁平苔蘚上皮長(zhǎng)期受炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著局部細(xì)胞因子水平改變，炎性因子網(wǎng)絡(luò)化激活可能促進(jìn)口腔鱗癌的發(fā)生。但也有學(xué)者認(rèn)為，IL-17高表達(dá)是非霍奇金淋巴瘤預(yù)后較好的指標(biāo)之一［7］。因此，IL-17在癌前病變及鱗癌中的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系尚需進(jìn)一步深入研究。

COX-2屬于誘導(dǎo)型酶，在大多數(shù)正常組織中不表達(dá)，在炎性因素等刺激下可誘導(dǎo)性表達(dá)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在癌基因、生長(zhǎng)因子的作用下也可表達(dá)。COX-2的過度表達(dá)在癌前病變組織中較早出現(xiàn)，甚至早于細(xì)胞凋亡周期改變。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)舌鱗狀細(xì)胞癌中COX-2表達(dá)水平與腫瘤侵襲性、轉(zhuǎn)移能力、預(yù)后等相關(guān)［8］。近年來對(duì)腫瘤微環(huán)境及發(fā)生、發(fā)展的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2表達(dá)水平上升與腫瘤血管形成關(guān)系密切［9-10］。本次研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在正?？谇火つぜ?xì)胞中幾乎不表達(dá)，50.0%的扁平苔蘚陽性表達(dá)，80.0%鱗癌陽性表達(dá)。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，COX-2在扁平苔蘚組與鱗癌組陽性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組，且鱗癌組陽性率高于扁平苔蘚組，與其他學(xué)者研究結(jié)果相近。Pandey等研究發(fā)現(xiàn)COX-2在正?？谇火つ?、癌前病變、口腔鱗癌中表達(dá)水平逐漸增高［11］。

口腔黏膜癌變的機(jī)制是臨床研究的熱點(diǎn)之一，特別是癌前病變進(jìn)展為腫瘤的過程，例如局部微環(huán)境的變化，細(xì)胞因子間的正、負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)，多種因子共同作用引起細(xì)胞生長(zhǎng)周期變化，刺激腫瘤血管生成等等［12］。本次研究初步發(fā)現(xiàn)IL-17與COX-2在口腔扁平苔蘚及鱗癌中均有不同程度的表達(dá)，但具體機(jī)制及對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響尚需進(jìn)一步深入研究，例如動(dòng)態(tài)觀察腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與IL-17、COX-2的關(guān)系，從而為臨床治療、預(yù)后評(píng)估提供參考。

［1］付榮明.原癌基因eIF4E在口腔鱗癌及切緣中的表達(dá)及其意義〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2009，24(5):477.

［2］錢 毅，喬文靜，馬葉華，等.人健康和炎性牙槽骨成骨細(xì)胞 COX-2、PGE2、OPG，RANKL 的表達(dá)〔J〕.口腔醫(yī)學(xué)研究，2010，26(4):529.

［3］盧 銳，周 剛.輔助性T淋巴細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子在口腔扁平苔蘚中的研究進(jìn)展〔J〕.國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，35(6):627.

［4］Nguyen CQ，Hu MH，Li Y，et al.Salivary gland tissue expression of interleukin-23 and interleukin-17 in Sjogren＇s syndrome:findings in humans and mice〔J〕.Arthritis Rheum，2008，58(3):734.

［5］劉國(guó)林，閆 威，陳 勇，等.口腔扁平苔蘚癌變的研究進(jìn)展〔J〕.腫瘤防治研究，2010，37(7):848.

［6］Su XM，Ye J，Hsueh EC，et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells〔J〕.J Immunol，2010，184(3):1630.

［7］Yang ZZ，Novak AJ，Ziesmer SC，et al.Malignant B cells skew the balance of regulatory T cells and TH17 cells in B-cell non-Hodgkin＇s lymphoma〔J〕.Cancer Res，2009，69(13):5522.

［8］Renkonen J，Wolff H，Paavonen Y.Expression of cyclo-oxygenase-2 in human tongue carcinoma and its precursor lesions〔J〕.Virchows Arch，2002，440(6):594.

［9］胡賢杰，郭貴龍，顧 馨，等.環(huán)氧化酶-2在甲狀腺乳頭癌中的表達(dá)及對(duì)淋巴管生成的影響〔J〕.實(shí)用腫瘤雜志，2008，23(4):338.

［10］馮正虎，李春青，楊 蘭，等.口腔鱗狀細(xì)胞癌中環(huán)氧化酶2的表達(dá)與淋巴管生成的相關(guān)性〔J〕.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，24(2):131.

［11］Pandey M，Prakash O，Santhi WS，et al.Overexpression of COX-2gene in oral cancer is independent of stage of disease and degree of differentiation〔J〕.Int J Oral Maxillofac Surg，2008，37(4):379.

［12］Sudha VM，Hemavathy S.Role of bcl-2 oncoprotein in oral potentially malignant disorders and squamous cell carcinoma:an immunohistochemical study［J］.Indian J Dent Res，2011，22(4):520.