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    MicroRNA-10b對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖及侵襲能力的影響

    2013-02-27 02:30:42李明慧郭文佳張國(guó)慶龐作良
    實(shí)用癌癥雜志 2013年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株培養(yǎng)液空白對(duì)照

    劉 翼 李明慧 郭文佳 張國(guó)慶 龐作良

    microRNA廣泛存在于真核生物中,與腫瘤的關(guān)系極為密切[1-3]。miR-10b作為miRNA家族中的成員之一,目前認(rèn)為其在多種實(shí)體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用[4-5]。最近的研究表明,與良性腫瘤患者相比,肺癌患者中miRNA-10b的水平明顯升高,而且,他們發(fā)現(xiàn)血清中miRNA-10b的高表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)miRNA-10b質(zhì)粒進(jìn)入人肺腺癌細(xì)胞株A549,觀察miRNA-10b對(duì)人肺癌增殖及侵襲能力的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞系和主要試劑

    人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)于CCTCC(China Center for Type Culture Collection,中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心);胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司,miRNA-10b真核表達(dá)質(zhì)粒由紐恩(上海)生物科技有限公司提供;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司;SYBRGreen PCR試劑盒購(gòu)自Thermo公司;CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;Transwell小室購(gòu)于康寧公司。A549在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)。

    1.2 方法

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板,設(shè)置成3個(gè)組,分別是:空白對(duì)照組,即未轉(zhuǎn)染組;陰性對(duì)照組,即空載體轉(zhuǎn)染組(NC序列:TTCTCCGAACGTGTCACGT);miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體 lipofectamineTM 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染 siRNA,具體操作步驟:在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞,培養(yǎng)過(guò)夜,將5 μl lipofectamineTM2000加入250 μl改良型必需基本培養(yǎng)基(opti-MEM)中,在室溫靜置5 min;5 μl的siRNA加入250 μl opti-MEM中;將二者混合,室溫放置20 min;吸去原有的細(xì)胞培養(yǎng)液,更換成無(wú)血清、無(wú)抗生素的培養(yǎng)液,再加入siRNA和500 μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染混合液混勻;在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)4~6 h后換成正常培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后24 h使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,確定轉(zhuǎn)染效率。

    1.2.1 檢測(cè)各組細(xì)胞中miRNA-10b的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,RNA樣品用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,使用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)樣本中miRNA-10b的相對(duì)表達(dá)量。特異性引物序列:miRNA-10b 上游引物:5'GGATACCCTGTAGAACCGAA-3',下游引物:5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3';內(nèi)參 U6 上游引物:5'-TGGGGTTATACATTGTGAGAGGA-3',下游引物:5 '-GTGTGCTACGGAGTTCAGAGGTT-3 '。 根 據(jù) 公 式R=2-△△Ct,計(jì)算目的基因相對(duì)含量。

    1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將每塊板設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,用胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞株,稀釋細(xì)胞[(1~5) ×104個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)液],取 100 μl至96孔培養(yǎng)板,每組分為24、48和72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn),按1∶10體積比混合無(wú)血清必需基本培養(yǎng)基DMEM和Cell Counting Kit-8(CCK-8),采用微板分光光度計(jì)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)吸光度。記錄數(shù)值,并制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

    1.2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前24 h將不同分組的細(xì)胞換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,接種前將transwell小室和24孔板用1×PBS浸泡5 min,用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞,接種到transwell小室內(nèi),0.5 ml細(xì)胞懸液加入每個(gè)小室,0.75 ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液加入下層的24孔板中,每組3復(fù)孔,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,固定,染色,transwell小室內(nèi)沒(méi)有遷移的細(xì)胞用棉簽擦去,顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值,采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),組間比較采用方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 轉(zhuǎn)染效率

    轉(zhuǎn)染24 h后,熒光顯微鏡下觀察,空白對(duì)照組未見(jiàn)綠色熒光,陰性對(duì)照組及miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中可見(jiàn)綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率高達(dá)70%。

    2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA-10b的表達(dá)

    轉(zhuǎn)染48 h后,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)3組細(xì)胞中miRNA-10b的RQ平均值,結(jié)果顯示,miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中 miRNA-10b表達(dá)明顯上調(diào)(RQ=1.34±0.13),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而陰性對(duì)照組(RQ=0.96 ±0.07)與空白對(duì)照組(RQ=0.99 ±0.08)比較,miRNA-10b表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖1。

    圖1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA-10b表達(dá)水平的變化

    2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖情況

    miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)速度高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05),而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異 (P>0.05,圖2)。

    圖2 miRNA-10b對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖的影響

    2.4 Transwell結(jié)果

    miRNA-10b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組有更多的細(xì)胞遷移到Transwell膜的另一側(cè)(P<0.05),而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05),說(shuō)明轉(zhuǎn)染miRNA-10b真核表達(dá)質(zhì)粒的A549細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。

    3 討論

    多種因素,如各種調(diào)控基因及細(xì)胞因子等,形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控。環(huán)境影響基因突變、可遺傳的表觀遺傳學(xué)改變等都能夠影響細(xì)胞的生物學(xué)性狀。microRNA作為調(diào)控性的小分子RNA,在腫瘤中的作用越來(lái)越受到重視。最近的研究表明,microRNA自身的調(diào)控,尤其是表觀遺傳學(xué)層次的調(diào)控,不但影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性,還對(duì)腫瘤的分期預(yù)后也具有相當(dāng)?shù)挠绊懠疤崾咀饔茫?-8]。

    miR-10b定位于HOX基因簇,它的功能不僅僅是維持正常組織的增殖分化,還在腫瘤的發(fā)生及侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用,有研究表明miR-10b促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[9-11]。我們的研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),將表達(dá)miRNA-10b的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中,獲得過(guò)表達(dá)miRNA-10b的A549細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,miRNA-10b表達(dá)量增高的細(xì)胞增殖速度加快;我們通過(guò)transwell檢測(cè)了A549細(xì)胞侵襲能力的改變,結(jié)果提示:過(guò)表達(dá)MiRNA-10b可以增強(qiáng)A549細(xì)胞侵襲能力。

    有研究表明,在肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,多種miRNA都可作為抑癌基因或癌基因起調(diào)控作用。我們可以通過(guò)導(dǎo)入外源的有抑癌基因功能miRNA,或者采用多種方法下調(diào)或抑制有抑癌基因功能的miRNA的表達(dá),起到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[12]。我們通過(guò)研究認(rèn)為:miRNA-10b可以促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲。我們有理由相信,隨著研究的進(jìn)一步深入,miRNA-10b靶基因及調(diào)控機(jī)制得以確定,miRNA-10b有可能成為肺癌治療的1個(gè)新的靶點(diǎn)。

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