TA29-Barnase轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜的獲得

王 倩 楊海鵬 鄒 敏 宋洪元

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400715）

芥菜〔Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.〕是我國特產(chǎn)蔬菜之一，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值較高，在我國南、北方均有種植，是重要的加工類蔬菜。在芥菜生產(chǎn)實踐中廣泛存在著諸如病毒病、先期抽薹、加工品質(zhì)等問題（楊景華 等，2006），植物雜種優(yōu)勢的利用可以在一定程度上解決這些問題。由于芥菜類作物自交親和指數(shù)非常高，雜種優(yōu)勢育種難以通過自交不親和途徑得以實現(xiàn)，導(dǎo)致長期以來芥菜類蔬菜品種選育都是以常規(guī)品種為主。雖然近年來利用細胞質(zhì)雄性不育在芥菜優(yōu)勢育種上取得了一定的進展，但如何發(fā)掘、創(chuàng)造優(yōu)良的芥菜雄性不育材料仍是當前芥菜雄性不育研究的重要內(nèi)容之一。隨著基因工程雄性不育系成功在油菜、玉米、菊苣等農(nóng)作物上得到商業(yè)化應(yīng)用（Kempken，2010），圍繞花粉的發(fā)育過程，已通過多種途徑建立了植物工程雄性不育系。利用具有特異時空表達特性的花藥絨氈層特異啟動子與解淀粉芽孢桿菌的Barnase核糖核酸酶基因融合，導(dǎo)入植物體內(nèi)調(diào)控花粉發(fā)育，從而獲得雄性不育材料成為其中應(yīng)用最為普遍的方法。該方法分別在花椰菜（Reynaerts et al.，1993）、煙草（李勝國 等，1995）、油菜（鐘蓉 等，1996）、甘藍（沈革志 等，2001）、番茄（白玲 等，2002）、菜薹（曹必好和孟成民，2008）等作物上成功獲得了雄性不育材料?；趯娌思毎|(zhì)雄性不育機制的研究，Yang 等（2010）將來自線粒體的編碼基因orf220導(dǎo)入莖用芥菜中獲得雄性不育材料。相對于其他農(nóng)作物，有關(guān)芥菜植物基因工程雄性不育的研究報道較少，為拓寬芥菜雄性不育資源，本試驗將煙草絨氈層TA29啟動子驅(qū)動下的Barnase基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入莖用芥菜，獲得了轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜植株，從分子水平、細胞學(xué)水平和結(jié)籽情況等方面調(diào)查分析了轉(zhuǎn)基因植株的育性，結(jié)果顯示Barnase基因在芥菜絨氈層特異表達后能導(dǎo)致徹底的雄性不育，但伴隨花朵變小，雌蕊、種莢變短，結(jié)籽數(shù)量下降的現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

含雄性不育基因的表達載體pCABarTA29-Bn的農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 由南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室保存（圖1）。

圖1 pCABarTA29-Bn 植物表達載體

1.2 試驗材料

試驗于2012年2月7日～7月15日在西南大學(xué)南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室進行。供試芥菜品種為渝豐榨菜，由重慶科光種苗有限公司提供。

TaqDNA 聚合酶和DNA marker 購自全式金生物工程有限公司；羧芐青霉素（Carbenicilin）、卡那霉素（Kanamycine）、鏈霉素（Streptomycin）、吲哚乙酸（IAA）、6 芐基腺嘌呤（6-BA）以及細菌培養(yǎng)基均購自北京鼎國生物技術(shù)公司；植物DNA 提取、植物組織培養(yǎng)以及顯微制片的各種化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純。除草劑Basta（草丁膦，主要成分為PPT）購自日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株氏會社。

1.3 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法（王關(guān)林和方宏筠，2002；曹必好 等，2003）進行轉(zhuǎn)化，并略有改動：取苗齡7 d 的渝豐榨菜幼苗的下胚軸，切成1 cm 長的莖段，在分化培養(yǎng)基（MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂）上預(yù)培養(yǎng)2 d，用濃度OD600=0.5～0.6的農(nóng)桿菌菌液侵染10 min，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d，隨后在篩選培養(yǎng)基（MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+8 mg·L-1PPT+400 mg·L-1Carb+3%蔗糖+0.6%瓊脂）上進行多次篩選，每14 d 換1次培養(yǎng)基，最后將再生植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基（MS+0.2 mg·L-1NAA+8 mg·L-1PPT+400 mg·L-1Carb+3%蔗糖+0.6%瓊脂）上進行生根培養(yǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的分子檢測

采用改進的CTAB 法提取芥菜總DNA（宋洪元 等，2010）。以提取的總DNA 為模板，用TA29啟動子上游引物（TA29-1：5′-CGCGGTACCCCAAGATTGCATAAG-3′）和Barnase基因下游引物（BN-2：5′-CCCCTCGGATCCGTTATCTGATCTTTGTA-3′）進行TA29啟動子及下游Barnase基因的PCR檢測。反應(yīng)體系：模板DNA 1μL（30 ng·μL-1），上下游引物各1μL （10 ng·μL-1），dNTP Mixture 0.2μL （2.5 mmol·L-1），MgCl22.0 μL（25 mmol·L-1），TaqDNA 聚合酶0.3 μL（5 U·μL-1），10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 補至總體積為25 μL。PCR 擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 轉(zhuǎn)基因芥菜植株花器官的觀察和授粉試驗

取轉(zhuǎn)基 因以及野生型芥菜植株當天開放的花，觀察比較雄蕊和花藥的形態(tài)結(jié) 構(gòu)。分別調(diào)查雄性不育轉(zhuǎn)基因芥菜植株自交以及用野生型芥菜植株的花粉進行人工授粉后的結(jié)籽情況。

1.6 轉(zhuǎn)基因芥菜植株雄性不育花藥、花粉發(fā)育的細胞學(xué)觀察

取芥菜轉(zhuǎn)基因雄性不育株和野生型可育株的不同大小花蕾，投入FAA 固定液固定至少24 h，之后按照常規(guī)石蠟法制作切片（鄒瑞昌 等，2012）：各級酒精脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→展片→脫蠟→染色，最后在LEICACTR5000 顯微鏡下鏡檢并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的獲得

芥菜幼苗下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌菌液浸染后，在含除草劑有效成分8 mg·L-1PPT 的培養(yǎng)基上進行多輪篩選，篩選過程中非轉(zhuǎn)化個體逐漸黃化死亡，抗性個體成苗并正常生根，生根后移栽到土壤中，獲得5株成活轉(zhuǎn)基因芥菜植株（圖2）。

提取成活植株DNA，利用引物TA29-1 和BN-2 進行PCR 擴增，在5株轉(zhuǎn)基因植株中均獲得了約630 bp 的DNA片段（圖3），表明外源目的基因已整合到芥菜植物基因組中。

圖2 轉(zhuǎn)化過程中芥菜植株生根和移栽成苗

2.2 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的花器官形態(tài)

盡管獲得的轉(zhuǎn)基因芥菜植株與野生型植株形態(tài)間無明顯差異，但開花時轉(zhuǎn)基因植株花朵偏小，并伴隨花瓣較小、雌蕊短且粗、雄蕊短縮的現(xiàn)象；而野生型植株則表現(xiàn)為花瓣大、雌蕊細長、雄蕊粗壯（圖4）。同時，轉(zhuǎn)基因植株花藥瘦小、干癟、無花粉囊及花粉；野生型植株則花藥飽滿，花粉囊充滿大量花粉（圖5）。

圖3 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的PCR檢測結(jié)果

圖4 轉(zhuǎn)基因芥菜植株花器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖5 轉(zhuǎn)基因芥菜植株花藥的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.3 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的花藥發(fā)育過程

在TA29啟動子的作用下，Barnase基因在花藥絨氈層組織細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生水解絨氈層組織細胞內(nèi)的RNA 的核糖核酸水解酶，阻礙花藥絨氈層的發(fā)育，從而導(dǎo)致雄性不育的產(chǎn)生。顯微切片結(jié)果顯示（圖6），花藥發(fā)育早期，轉(zhuǎn)基因芥菜植株與野生型植株均在花藥的4個角隅處形成正常的藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層和造孢細胞，呈蝴蝶形排列（圖6-1，6-4）。野生型植株進入減數(shù)分裂期，花粉母細胞變?yōu)闄E圓形，絨氈層細胞體積增大；進入單核初期，剛釋放出來的游離小孢子形狀不規(guī)則，細胞壁很?。粏魏送砥?，細胞壁逐漸加厚且趨于圓球形，絨氈層開始降解（圖6-2）；單核小孢子發(fā)生有絲分裂后，進入二核期，絨氈層只余殘跡，生殖核再次有絲分裂形成兩個精核，花粉粒趨于成熟，絨氈層最后在花藥即將開裂釋放花粉粒時已完全消失（圖6-3）。而轉(zhuǎn)基因植株的花藥中，當花粉母細胞開始進入減數(shù)分裂時，藥室內(nèi)壁的絨氈層細胞已經(jīng)開始降解，并伴隨花粉母細胞的退化（圖6-5）；減數(shù)分裂后絨氈層細胞和花粉母細胞進一步退化解體，無小孢子母細胞釋放，藥室呈現(xiàn)空洞狀（圖6-6）。

圖6 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的花藥發(fā)育過程

2.4 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的結(jié)實性

轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜植株開花后，自交花朵的果莢基本不能膨大，部分脫落，無種子形成（圖7-A1），而野生型植株則結(jié)籽正常（圖7-B）。轉(zhuǎn)基因植株用野生型植株的花粉授粉后，基本均能結(jié)實（圖7-A2），但與野生型植株（圖7-C2）相比果莢較短，不飽滿，且種子數(shù)少（圖7-C1）。該結(jié)果顯示煙草TA29啟動子驅(qū)動Barnase基因在芥菜植株的花藥絨氈層表達后，除了影響絨氈層細胞的發(fā)育從而獲得雄性不育外，對雌蕊以及其他花器官的發(fā)育也有一定的影響。

圖7 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的結(jié)籽情況

3 結(jié)論與討論

TA29是從煙草中克隆的一個絨氈層特異表達基因，在煙草減數(shù)分裂期到小孢子有絲分裂期的絨氈層中特異表達，在其他器官和花的其他組織中均沒有表達 （Koltunow et al.，1990）。該啟動子驅(qū)動Barnase基因在絨氈層中表達后獲得了煙草和油菜雄性不育材料（Mariani et al.，1990）。隨后基于TA29-Barnase雄性不育的轉(zhuǎn)基因油菜獲得商業(yè)化應(yīng)用。然而，后來有研究顯示TA29-Barnase基因?qū)е碌男坌圆挥龑囟让舾?，在溫度升高后轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)不同程度的育性恢復(fù)現(xiàn)象。如在轉(zhuǎn)基因煙草和油菜的研究中發(fā)現(xiàn)，當溫度低于20℃時不育性穩(wěn)定，溫度升高到25℃時開始轉(zhuǎn)育，30℃時大部分可育（鐘蓉 等，1996）。另外，TA29-Barnase基因轉(zhuǎn)化甘藍后發(fā)現(xiàn)雄性不育植株的園藝學(xué)性狀與未轉(zhuǎn)化植株相同，不育植株的花朵表現(xiàn)為雄蕊完全退化，但蜜腺和雌蕊健全，能接受外來花粉，雜交結(jié)實率較高，但是轉(zhuǎn)基因植株中存在全不育植株和半不育植株，半不育植株在開花中后期出現(xiàn)育性恢復(fù)現(xiàn)象（沈革志 等，2001）。該基因在 菜薹中表達后產(chǎn)生的雄性不育植株在30～35℃/25～28℃的高溫條件下自交全部不能結(jié)籽，沒有育性恢復(fù)現(xiàn)象發(fā)生（曹必好和孟成民，2008）。本試驗利用該基因獲得的芥菜雄性不育植株的生長發(fā)育全程處于控溫條件下的人工氣候室內(nèi)，其雄性不育性是否受田間溫度變化的影響有待進一步研究。通過原位雜交和啟動子報告基因的轉(zhuǎn)基因分析顯示，TA29基因?qū)Ｒ恍缘卦诮q氈層細胞中表達，表達時期為減數(shù)分裂期到花粉壁增厚期（-1 到+6 期）（Koltunow et al.，1990）。但在棉花中的研究結(jié)果顯示，該啟動子除了在棉花花藥中優(yōu)勢表達外，其控制的基因也會在棉花的葉片表皮毛和花粉中表達（尹夢回 等，2008）。同時，TA29-Barnase轉(zhuǎn)基因棉花除花藥干癟、花粉無活力外，也表現(xiàn)出花朵變小、花絲變短等現(xiàn)象（Zhang et al.，2007），這與本試驗所獲得的芥菜雄性不育轉(zhuǎn)基因植株的花器官類似。但本試驗獲得的雄性不育芥菜植株除了上述特點外，還出現(xiàn)了雌蕊偏短、種莢變短的現(xiàn)象，說明TA29-Barnase基因在芥菜中表達后，對非靶標組織的影響相對其他已報道的植物更大。因此，在利用Barnase基因創(chuàng)建芥菜雄性不育系時，有必要尋找更為嚴謹?shù)慕q氈層啟動子表達Barnase基因，減少對花器官中非靶標細胞、組織發(fā)育的影響，獲得結(jié)籽能力正常的雄性不育系，從而實現(xiàn)一代雜種的經(jīng)濟有效地繁育。

白玲，劉凡，李鎖平，曹鳴慶.2002.農(nóng)桿菌介導(dǎo)Barnase基因轉(zhuǎn)化番茄.河南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，32（3）：16-19.

曹必好，雷建軍，宋洪元，秦耀國.2003.芥菜農(nóng)桿菌高效遺傳轉(zhuǎn)化體系初步建立.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，4（4）：48-51.

曹必好，孟成民.2008.TA29-Barnase基因轉(zhuǎn)化菜心.生物工程學(xué)報，25（5）：881-886.

李勝國，劉玉樂，朱鋒，羅玉英，康良儀，田波.1995.基因工程雄性不育煙草的獲得.植物學(xué)報，37（8）：659-660.

沈革志，王新其，朱玉英，楊紅娟，陸桂華，王江，宛新衫，張景六.2001.TA29-Barnase基因轉(zhuǎn)化甘藍產(chǎn)生雄性不育植株.植物生理學(xué)報，27（1）：43-48.

宋洪元，任雪松，司軍，李成瓊，宋明，雷建軍.2010.利用Cre/lox 重組系統(tǒng)獲得煙草TA29-Barnase基因工程雄性不育恢復(fù)系.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，18（3）：468-475.

王關(guān)林，方宏筠.2002.植物基因工程.北京：科學(xué)出版社：742-744.

楊景華，張明方，喻景權(quán)，陳竹君.2006.莖用芥菜細胞質(zhì)雄性不育系及其保持系SPOROCYTELESS基因研究.園藝學(xué)進展，（7）：416-419.

尹夢回，董靜，李先碧，侯磊，羅明，李德謀，裴炎，肖月華.2008.煙草絨氈層特異啟動子pTA29在棉花中的表達特性.作物學(xué)報，34（12）：2092-2098.

鐘蓉，劉玉樂，朱鋒，李勝國，康良儀，羅鵬.1996.TA29-Barnase基因?qū)е掠筒诵坌圆挥难芯?植物學(xué)報，38（7）：582-585.

鄒瑞昌，萬正杰，徐躍進，楊文杰，傅延棟.2012.新型葉用芥菜細胞質(zhì)雄性不育系0912A 的花藥發(fā)育特征.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，31（1）：44-49.

Kempken F.2010.Engineered male sterility.Genetic Modification of Plants-Biotechnology in Agriculture and Forestry，64（2）：253-265.

Koltunow A M，Truettner J，Cox K H，Wallroth M，Goldberg R B.1990.Different temporal and spetial gene expression patterns occur during anther development.Plant Cell，2：1201-1224.

Mariani C，de Beuckeleer M，Truettner J，Leemans J，Goldberg R B.1990.Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene.Nature，347：737-741.

Reynaerts A，van de Wiele H，de Sutter G，Janssens J.1993.Engineered genes for fertility control and their application in hybrid seed production.Scientia Horticulturae，55：125-139.

Yang J H，Liu X Y，Yang X D，Zhang M F.2010.Mitochondrially-targeted expression of a cytoplasmic male sterility-associatedorf220gene causes male sterility inBrassica juncea.BMC Plant Biology，10：231.

Zhang H J，Wang H Y，Shi Y J，Zhang Y M，Yue J X，Wu S J，Zhu Y H，Liu Y L，Yang H Y.2007.Cotton genetic tranformation ofBarnasemale sterility gene.Cotton Sci，19（4）：261-266.