楊凌番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因的克隆與其核心序列分析

李云洲 梁 燕 王巧麗 李 翠 崔 霞 秦 蕾

（西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100）

番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl vius，TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviruses）菜豆金色花葉病毒屬（Begomoviruses），能侵染6科13種植物（Cohen & Nitzany，1966；Cohen et al.，1995；Navas-Castillio et al.，1999；Sánchez-Campos et al.，1999，2000；Ji et al.，2012），主要通過煙粉虱傳播（Cohen & Antignus，1994；Gafni，2003），感病植株表現(xiàn)明顯矮化，葉緣黃化，葉片變小并卷曲，以植株上部幼嫩葉片癥狀典型，嚴重危害番茄生長、開花和坐果，導致毀滅性絕產(chǎn)。該病于20世紀50年代末始發(fā)于以色列，20世紀90年代以來，由于全球氣候變暖和煙粉虱的空前擴展，該病害在40 多個國家大面積暴發(fā)并逐年加重，目前，該病已成為威脅世界番茄生產(chǎn)的主要因素之一（Czosnek & Laterrot，1997）。由于雙生病毒為單鏈DNA 病毒，存在基因重組現(xiàn)象，病毒變異頻率高，越來越多的此類病毒在世界各地被分離出來。

迄今為止，世界各地已經(jīng)相繼報道了幾十個分離物全序列，根據(jù)分離物地區(qū)不同可分為：TYLCV-Is（以色列番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Sar（撒丁番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Th（泰國番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Ye（也門番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Ch（中國番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Ng（尼日利亞番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-Tz（坦桑尼亞番茄黃化曲葉病毒），TYLCV-SSA（沙特阿拉伯番茄黃化曲葉病毒）等（Moriones & Navas-Castillo，2000）。目前，該病已遍布我國各主要番茄主產(chǎn)區(qū)，引起該病的病毒也發(fā)生不同程度的變異。

因此有必要將我國番茄黃化曲葉病分離物進行鑒定、分類，CP基因的同源性是病毒株系劃分主要的依據(jù)之一（Padidam et al.，1999），本試驗通過克隆我國陜西楊凌（中國農(nóng)業(yè)高新技術產(chǎn)業(yè)示范區(qū)）地區(qū)番茄作物上的TYLCV 外殼蛋白基因，對其核心序列tCP進行測序和同源性分析，并且根據(jù)核酸同源性進行分類，以期為番茄黃化曲葉病抗病育種提供分子生物學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗于2011年8月～2012年7月在西北農(nóng)林科技大學園藝學院番茄種質(zhì)創(chuàng)新實驗室進行，選取陜西楊凌地區(qū)感病番茄植株生長點及上部幼嫩葉片，錫箔紙包裹后置液氮冷凍5 min后凍于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 載體與菌株 pMD18-T 購于大連寶生物公司。大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)DH5α 購自天根生化公司（北京）。

1.2 方法

1.2.1 總DNA 的提取 采用改良CTAB 法提取番茄植株總DNA（Yan et al.，2008）。

1.2.2 引物設計及擴增 雙生病毒特異引物（吳劍柄，2008）、CP基因及tCP引物序列見表1。PCR 反應體系為50 μL：20 μL ddH2O+20 μL MiX+2 μL PA+2 μL PB+6 μL DNA 模板。反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；4℃保存，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后進行回收純化（Bio Kete 瓊脂糖凝膠回收試劑盒），用于下一步反應。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的克隆與測序 由高保真Pfu聚合酶擴增得到PCR 產(chǎn)物純化后，用A-tailing 試劑盒加A 尾與pMD18-T 載體連接成pMD18-T+tCP（Pfu聚合酶 pMD18-T 以及A-tailing 試劑盒均購于沃爾森生化試劑公司），參照薩布魯克等（1999）所述的熱激法將此連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細胞中，重組子經(jīng)鑒定后送上海桑尼生物科技有限公司測序。

表1 用于PCR 擴增和測序的引物序列

1.2.4 序列分析與同源性比較 采用DNAstar 中MegAlign 軟件的ClustalW 方法，將TYLCVCP核心序列tCP進行同源性分析，構建系統(tǒng)進化樹。在http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html 網(wǎng)址完成對tCP序列二級結(jié)構的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離物的初步鑒定

根據(jù)吳劍柄（2008）的雙生病毒特異引物PA、PB 進行PCR 擴增，得到500 bp 左右的雙生病毒特異產(chǎn)物（圖1），初步斷定所得到的楊凌分離物為雙生病毒，根據(jù)其田間發(fā)病特征：葉片褪綠黃化、變小，葉緣皺縮，葉片增厚，葉質(zhì)變硬，番茄植株矮化生長停滯，推斷該病毒為番茄黃化曲葉病毒引起，暫時命名該病毒分離物為TYLCV-Yl（GenBank 序列號：KC293824）。

2.2 TYLCV-Yl 外殼蛋白全序列的克隆與測序

為了保證目的片段擴增和測序的準確性，設計引物時在目的片段CP5′和3′端分別延伸350 bp 左右，克隆出的目的片段為1 400 bp（圖2），TYLCV-Yl 外殼蛋白全基因序列如圖3，ATG為起始序列，TAA 為終止序列，共計777個核苷酸。該序列與NCBI 中以色列番茄黃化曲葉病毒序列（X15656）基因同源性高達97%。

圖1 TYLCV-YL 的初步PCR 鑒定結(jié)果

圖2 TYLCV-Yl CP PCR 產(chǎn)物擴增結(jié)果

2.3 基于CP 蛋白核苷酸序列多重比較

圖4是基于CP蛋白基因的核苷酸序列多重比較結(jié)果，可見編碼CP蛋白基因的5′端高度保守，19個TYLCV 的起始密碼均為ATG，起始密碼之后最長的連續(xù)保守序列為TCATTTCCAC。

2.4 TYLCV-Yl 外殼蛋白核心序列tCP 的克隆

圖3 楊凌番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白全基因序列

利用引物tCP-F 和tCP-R 進行PCR 擴增，得到1條420 bp 左右的片段（tCP）（圖5），1～5 點樣孔為同一植株毒源PCR 產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物進行再次驗證（圖6），顯示克隆結(jié)果良好。使用Dnstar 軟件分析tCP，其包含1個開放性閱讀框，編碼137個氨基酸（圖7）。

2.5 tCP 序列特征分析

核苷酸序列同源性比對結(jié)果表明，本試驗克隆的TYLCV-YlCP基因與NCBI 中的18個TYLCV 病毒序列的同源性如表2所示。如圖4所示該tCP基因序列5′端在諸多TYLCV 核酸序列中非常保守。

表2 NCBI 中18個TYLCV 登錄號及其CP位點

圖4 19個TYLCV 的tCP 基于核苷酸序列的多重比對結(jié)果

圖5 tCP基因片段PCR 擴增結(jié)果

圖6 tCP 回收產(chǎn)物PCR 驗證結(jié)果

圖7 楊凌番茄黃化曲葉病毒外殼tCP片段序列及推測氨基酸序列

tCP核苷酸序列中GC含量為46.28%，預測蛋白分子量為15 813.83 D，等電點為11.336?？缒し治鼋Y(jié)構顯示（圖8）：tCP具有1個跨膜結(jié)構，該跨膜結(jié)構位于79～97個氨基酸之間。

圖8 tCP 蛋白跨膜區(qū)的預測結(jié)果

2.6 系統(tǒng)進化樹分析

將tCP基因序列與NCBI 中已登錄的18種TYLCV 的CP蛋白構建進化樹（圖9），這19個TYLCV CP蛋白序列可以明顯的分為3個亞組：亞組Ⅰ，亞組Ⅱ，亞組Ⅲ。亞組Ⅰ同源性＞90%，亞組Ⅱ同源性＞80%，亞組Ⅲ同源性＞70%。說明CP在TYLCV 進化過程中保守性非常強。其中tCP基因序列被歸為亞組Ⅰ。由本試驗結(jié)果可知，中國番茄黃化曲葉病由兩個病毒亞組引起，即TYLCV 亞組Ⅰ和TYLCV 亞組Ⅱ。

圖9 基于CP基因序列構建的分離物TYLCV-YL 與其他株系的系統(tǒng)樹

3 結(jié)論與討論

本試驗將番茄黃化曲葉病毒劃分3個亞組，中國境內(nèi)番茄黃化曲葉病毒有2個亞組，即TYLCV 亞組Ⅰ和TYLCV 亞組Ⅱ。其中TYLCV 亞組Ⅰ中的TYLCV-Is（以色列）TYLCV 和TYLCV-Sar（意大利撒丁地區(qū)）是最早分離并且報道其全基因序列的（Kheyr-Pour et al.，1991；Navot et al.，1991）。隨后越來越多的TYLCV 分離物的全基因組序列被公布。經(jīng)過序列比較分析，發(fā)現(xiàn)侵染番茄的一系列Begomoviruses病毒親緣關系或近或遠，僅用TYLCV 對這類復雜的病毒進行命名明顯已不恰當了。國際病毒分類委員會將雙生病毒科病毒全基因組核苷酸序列同源率小于90% 的往往定名為不同病毒（Regenmortel & Fauquet，2000），因此本試驗的TYLCV病毒劃分是有科學依據(jù)的。而且本試驗將亞組用于區(qū)分當前眾多的TYLCV 分離物，并不是先例，Palukaitis 等（1992）、Rizos 等（1992）曾將亞組用于區(qū)分同CMV 病毒的縱多分離物，這樣根據(jù)病毒核酸序列的同源性將TYLCV 劃分成3個亞組不僅可以明白諸多TYLCV 病毒的進化關系，也有利于針對相應病毒展開防治工作。

本試驗結(jié)果可知，中國番茄黃化曲葉病由兩個病毒亞組引起，即TYLCV 亞組Ⅰ和TYLCV亞組Ⅱ，楊凌番茄黃化曲葉病毒（TYLCV-Yl）屬于以色列番茄黃化曲葉病毒株系。一方面說明地源近的番茄黃化曲葉病可能由同一病毒亞組引起，如臺灣番茄黃化曲葉病毒和廣東番茄黃化曲葉病毒均屬于TYLCV 亞組Ⅱ，另一方面也證明番茄黃化曲葉病毒在中國境內(nèi)傳播過程中確實存在變異。

除此之外，應該加強對中國境內(nèi)其他TYLCV-CP蛋白的研究，以期為抗病育種提供分子生物學依據(jù)。Abel 等（1986）首次將煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草并成功的獲得了抗煙草花葉病毒TMV 侵染的轉(zhuǎn)基因植株。到目前為止，這一技術已成功應用在十幾個屬30余種病毒上。同時CP蛋白作為病毒的結(jié)構基礎由ORFν1編碼，Gafni 和Epel（2002）發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白（TYLCV-CP）對于病毒的侵染和移動是非常必要的。Noris 等（1996）也發(fā)現(xiàn)TYLCSV（撒丁番茄黃化曲葉?。〤P突變體可以干擾病毒的侵染。而本試驗對TYLCVYlCP核心序列tCP進行分析，因為tCP有一個跨膜結(jié)構，一旦該片段缺失，將影響到病毒結(jié)構的完整性，以至于影響其功能，因此通過抑制番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白（CP）基因核心序列tCP的表達，以阻止病毒在植物體內(nèi)繼續(xù)組裝、擴繁，達到抗病的作用。

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